牛病毒性腹泻病毒的检测方法及净化研究进展

王廷龙,刘俊峰,张淑琴

（1．塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

牛病毒性腹泻又叫牛病毒性腹泻粘膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD），是由牛病毒性腹泻病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种以腹泻为主的粘膜病。该病流行范围极广，在全世界各地都有流行记录。在国际上，已经有国家宣称已彻底消灭净化BVD。随着养牛业飞速发展，因本土牛种的缺陷和不足，需要从国外引进牛胚胎、精液等产品，导致BVD 的传入机会增加。该病在我国20 多个省（市、自治区）均有检出[1]。

健康牛感染BVDV 后，可引发多种临床症状。发病时多数牛临床症状表现不明显，牛群中可见少数轻型病例，有时也引起全牛群突然发病。急性病牛，腹泻是特征性症状，可持续1～3 周。病牛粪便水样、恶臭，有大量粘液和气泡，体温升高达40～42℃。慢性病牛，出现间歇性腹泻，病程较长，一般2～5 个月，表现为消瘦、生长发育受阻，有的出现跛行，部分牛逐渐发展成持续性感染（Persistent infection，PI）牛。BVDV 导致的病变主要集中在消化道粘膜和淋巴结，BVDV 若感染妊娠母牛可能会导致产畸形胎儿、流产或产出PI牛[2]，造成较大的经济损失。该病毒主要在偶蹄类动物中广泛传播，严重危害全球牛、羊等反刍动物养殖业的发展，造成的经济损失不容小觑[3]。

PI牛对养牛业的危害最大，PI牛指的是BVDV在牛体内长期存在而未被清除，其在宿主体内潜伏长达数月至数年，甚至宿主不能清除病毒而终生携带病毒。PI牛隐藏在健康牛群中难以发现，不表现出临床症状。犊牛在胚胎发育早期或初生期时，机体免疫器官、免疫组织尚未发育成熟，BVDV 进入免疫器官，会导致免疫细胞的程序性死亡，从而产生病毒的持续性感染，成为PI 牛。PI 牛向环境中散播着大量的病毒颗粒，成为牛群中的主要传染源。由于PI 牛免疫力下降，易受机会致病菌侵袭，感染其他疾病的几率相较于正常牛要高，由此所造成的间接经济损失巨大。全世界各地区每年死于BVD 的牛不少于500 万头，BVDV 造成的经济损失并不仅仅体现在病牛的死亡，感染BVDV后病牛生产性能下降，料肉比升高；此外，怀孕母牛感染BVDV 会出现胎儿流产、死亡等现象。随着国民经济的发展，国内消费者对肉类等动物性食品的需求结构发生改变，而国内的牛肉产能不足，为了满足国内消费者对于牛肉、牛奶等动物类食品的消费的要求，近年来，我国从澳大利亚、新西兰进口的种牛、乳用牛、牛肉类产品数量急剧增加，牛类副产品进口贸易的频繁，导致BVDV 传入国内的几率也随之增高。因此加强我国规模化养牛场BVDV的检疫和防治刻不容缓，本文将该病的最新研究进展进行了简要综述。

1 检测方法

BVDV 的检测方法有电镜检查、间接免疫荧光染色技术（IFA）、酶联免疫吸附技术（ELISA）、反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）、基因芯片等技术。每种方法都有其自身的特点，电镜检查对设备的要求较高，只适用于实验室检查；IFA技术由于检测周期长，操作繁琐，固不适用于规模化牛场的大规模筛查；RT-PCR 由于对操作人员素质要求较高，检查成本高，不适合用于生产中。基因芯片价格昂贵，筛查成本极高，ELISA 方法因准确率高、成本低，适用于大规模检测等特性而被广泛用于生产中[4-5]。

1.1 电子显微镜检查

将采集病料研磨，离心（约4 500 r/min）后，取上清液，滤器（0.22m）滤过得到BVDV 液，将病毒液加入单层易感细胞，孵育约1 h，孵育期间每隔15 min 晃匀1 次，保持细胞与病毒液充分接触，使得病毒充分的吸附在易感细胞表面；1 h后弃去病毒液并加入含有3.5%马血清的 DMEM 作为维持液；约3 d 后（72 h 左右），将细胞反复冻融，并使用磷酸钨染色在电镜下观察病毒颗粒。由于磷酸钨的原子较有机物中的C、H 原子更易能阻挡电子，电子无法透过磷酸钨染色的区域。因此，在电镜下黑色区域为磷酸钨，而BVDV 颗粒的颜色则较浅或者无色；可以观察到成熟的BVDV粒子呈球形，病毒颗粒直径约46 nm[6]。

1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附实验，是利用抗原体之间专一性结合的特点对待检测物进行检测。由于结合于固相载体的抗原或抗体仍具有生物学活性，配合酶联抗体呈色反应，根据其显色与否来判断抗原或抗体是否存在，然后再进行定性分析，也可利用析光度进行定量分析。酶联免疫吸附试验方法包括间接ELISA，双抗体夹心、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA、抗体捕捉ELISA、斑点 ELISA、布 ELISA 等方法。

双抗体夹心法属于酶联免疫吸附试验的一种。将含有已知对BVDV 具有特异性的抗体吸附在固相载体上。加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，洗去多余待检抗原，加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，形成“夹心”；加放显色剂孵育显色，用酶标仪检测每个孔的吸光度，按照说明书上给出的公式判断是否有效并确定样品中是否含有BVDV 抗原。

1.3 免疫荧光染色技术（IFA）

免疫荧光染色技术的基本原理并不复杂，用具有荧光效应的标记物标记特异性抗体，由于抗原抗体特异性反应，可以通过标记物判断出抗原所在的位置和抗原的量。荧光素标记的特异性抗体可用于检测临床样本中是否含有BVDV，只有BVDV所具有的抗原表位和荧光素所标记的特异性抗体发生抗原抗体反应，IFA 才具有有效性。

免疫荧光技术分为间接免疫荧光技术和直接免疫荧光技术，间接免疫荧光技术通过特异性一抗和相应抗原特异性结合，结合后用PBS 洗去未结合的一抗，再加入和一抗特异性结合标记有荧光素的二抗，在荧光显微镜下观测荧光；直接免疫荧光技术在一抗上标记有荧光素，和抗原特异性结合后，PBS 洗涤，直接在荧光显微镜下观察荧光。两种方法相比较而言，直接免疫荧光法比间接免疫荧光法要更加简便，但由于间接荧光检测法可能会出现非特异性染色，准确性比直接荧光检测法差[7]。

抗原抗体结合形成引物二聚体后，通过洗涤除去未与相应抗原结合的带有荧光素标记的抗体，再通过荧光显微镜观察，如若视野中出现荧光，则该样本就被该种病毒所侵袭；反之，该样本未被该病毒所侵袭。

1.4 基因芯片检测方法

基因芯片的测序原理是杂交测序，杂交测序的基本原理就是碱基互补配对原理。通过人工设计并合成一组已知序列的寡核酸探针，人工合成的寡核苷酸序列和待检测基因遵循碱基互补配对原则进行结合，即在一块固态基片表面固定已知序列的寡核苷酸，当待检测溶液中带有荧光标记的待检核酸序列与基因芯片上对应位置的寡核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，可确定待检基因的序列。魏春霞等[8]报道了牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎的可视化基因芯片检测方法。

1.5 反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）

通过Trizol 提取试剂盒提取RNA，用反转录试剂盒将 RNA 反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板进行PCR 扩增，获得目的条带后送样测序，测序结果经NCBI 比对。采用此种方法可以用于特异性检测病料组织、体外细胞培养物中的BVDV，检测结果可与猪瘟、边界病病毒以及BVDV 不同毒株区分出来，准确性极高，且具有较高的区分度。

1.6 纳米PCR检测方法

纳米PCR 技术是新型的PCR 技术。米丽娟等[9]发现纳米金粒子的浓度和酶量比值的不同，PCR 反应体系中DNA 聚合酶的活性会发生相应的改变，由此推测 DNA 聚合酶会与纳米金之间结合是可逆性的，通过动态调节聚合酶的更替频率，进而可影响聚合酶活性的PCR 的扩增结果。由于纳米金良好的导热性，在PCR 反应体系中加入纳米金后可以使其更快达到目标温度，降温时也能更快地降温，使得升温、降温过程变短，从而减少了非特异性扩增物的产量，使得PCR反应的特异性升高，缩短了PCR 的反应时间[10-15]。

2 牛病毒性腹泻的净化

2.1 世界各国对牛病毒性腹泻的净化措施

BVDV 在世界范围内流行程度有所有同。据报道，美国牛群中BVDV 的血清学检测阳性率约50%；加拿大有些地区血清学阳性率甚至超过80%；澳大利亚牛群中BVDV的血清学检测阳性率为89%，以上地区的血清学阳性率平均为 70 %，而临床发病率为24%～47%。北美地区分离到的BVDV 毒株50%以上为 BVDV2（基因 2 型），而欧洲分离株的 90%是BVDV1（基因 1 型）[16-17]。

世界各国对BVD 防控净化措施存在很大差异。其中，瑞士、挪威、丹麦等北欧发达国家对BVD 的重视程度较高，由国家引导对BVD 进行防控与净化，取得了良好的效果；新西兰、美国等国家部分地区完成了对BVD 的净化；而从整体来看，我国BVD 的流行还未得到有效控制。

当缺乏抗体保护的牛受到BVDV强毒株感染后，会引发严重的临床症状[18-19]。BVDV 在牛体内经过一段短暂的潜伏期后，就可能发展成病毒血症，约在感染后4～15 d，BVDV 会随着动物的唾液、精液、乳汁等分泌物排出体外[20]。PI 牛与急性BVDV 感染牛相比，其病毒血症会更严重、更持久。PI 牛体内的病毒会随着分泌物而排出体外，与分泌物相比，通过粪便所排毒量是最少的[21-23]。妊娠母牛被BVDV 感染后可能导致流产，流产的胎儿、胎盘、胎液中都可检测到BVDV[1]。Traven 等[24]研究发现，BVDV 血清阴性牛与一只PI牛直接接触仅1 h就会通过水平传播途径感染BVDV，BVDV 的疫苗注射对于BVD 的防控十分重要[25-26]。

2.2 我国净化牛病毒性腹泻的相关建议

BVDV 在牛群中的传播主要是以PI 牛为重要的传染源，所以，淘汰PI 牛是控制BVDV 感染及传播的首要任务。母牛可以通过母婴传播将病毒传染给胎儿，所以，繁殖季节来临前要筛查出牛群的PI母牛，并将其清除干净。同时也要采取必要措施使感染BVDV病牛和PI牛尽可能远离繁殖种群，防止发生水平传播使怀孕母牛感染，尽而发展为垂直传播。养牛场应对所有参加繁殖的母牛进行检测，以确保所产的小牛为BVDV 阴性牛。PI 牛可以通过全血（白细胞）或其他组织分离和检测到BVDV，而处于潜伏期未显示出临床症状的带毒牛，可以通过IPMA、IHC、ELISA和PCR方法加以检测[27]。

对BVDV的防控和净化的基本方案有2 种，一种是“筛查-淘汰”方案，即对牛群中做抗原筛查，筛选出所有抗原呈阳性的牛，并予以淘汰，彻底清除BVDV的传染源。如筛查-淘汰后较长一段时间内监测不到阳性牛，说明筛查-淘汰方案成功，否则将继续进行筛查淘汰，直至测底清除为止。该策略在瑞典、挪威等国家已取得成功，此种方案适用于养牛密度较低的地区，同时需要配合实施严格的生物安全管理和防疫制度，才能彻底净化BVDV。另一种是“免疫+淘汰”方案，其核心是用疫苗高强度免疫，同时加强血清抗原检测，在免疫后一段时间进行血液抗原检测，发现抗原呈阳性个体则立即清除，同样需要配合严格的生物安全控制和防疫制度，逐步实现BVDV 的净化。这一策略在美国和德国已取得成功，适用于养牛密度较高的地区。

从我国国情来看，既有大规模养殖，也有小规模养殖。因此，对于养殖规模小而分散的地区，可采取“筛查-淘汰”方案，其净化速度快、损失小；对于养殖规模大而集中的地区可以采取“免疫+淘汰”方案，通过免疫可以对健康牛进行有效保护，从而避免造成更大损失。

2.2.1 建立有效的免疫 疫苗免疫在实现BVDV 净化的过渡阶段中发挥着关键作用，因为在逐步净化BVDV 的过程中仍然存在一过性感染，或者逃避过监测的PI 牛，在净化过程中仍然不断感染健康牛群，给净化带来了更大的难度。因此，在净化BVDV 的过程中，仍然需要加强BVDV 的免疫。但是，血清的抗体检测要在免疫之前进行，因为注射疫苗后会产生抗体干扰检测结果。注射疫苗后，采取免疫组化方法来检测BVDV 的感染牛。

2.2.2 清除PI 牛 牛病毒性腹泻病群内流行的主要传播源就是PI 牛。由于PI 牛对病毒的抵抗力几乎为零，病毒在PI 牛体内的繁殖极为迅速，使得PI 牛成为病毒培养的温床，同时PI牛向周围环境中散播大量的病毒颗粒，使得病毒在牛群中传播。因此，筛查并清除PI 牛是有效控制和净化BVDV 的最佳方法[28-29]。

目前，采用皮肤免病组化法是对牛群进行BVDV净化最好的方法。BVDV 一过性感染牛的内脏器官经免疫组化检验呈阳性，当采用皮肤样品检测时，一过性感染牛的样品不着色或者仅仅角质细胞和滤泡着色，但PI牛的表皮所有细胞均着色，包括毛囊和毛球。该方法适用于区分PI 牛和一过性感染的牛。

免疫组化检验适用于对任何日龄牛群的筛查。免疫组化法检验皮肤样品，不会因使用BVDV弱毒疫苗免疫动物而导致假阳性的出现。此外，皮肤样品易采集、方便操作和运输，对于PI 牛的检验敏感且具有特异性，因此，对PI 牛的淘汰具有重要意义。

当被检验牛的临床症状和病史与免疫组化法检验结果不一致时，还应采用其他检验方法进行重复检验。应用病毒分离或者PCR 方法鉴定PI 牛，需要至少在3 d后对阳性样本进行二次检验，才能区别其是BVDV一过性感染还是持续性感染，因为牛感染BVDV可能会自愈，并不一定是持续性感染。

2.2.3 生物安全 大型养殖场引进国外的优良种牛、精液、卵子等生物产品时，必须进行严格的检疫合格方可入场使用，坚决杜绝外源感染。BVDV 感染不仅对多种动物（其中也包括野生动物）健康造成直接影响，而且它还是牛源和猪源生物制品潜在污染源。《中国药典》第三部（2010 版）将BVDV 列为犊牛血清的必检项目，也是我国活牛进口重点检疫的疫病之一[30]。

精液 在配种过程中，未经检疫的种公牛的精液，存在种公牛为PI 牛的风险。根据对PI 牛精液中BVDV含量检测结果可知，其精液中 BVDV 排出量很高(104～106TCID50/mL)[31]。当含有 BVDV 的精液进入母牛子宫，母牛体内不具有BVDV 抗体时，母牛的受孕率就会大幅度降低；若母牛体内含有BVDV 抗体，则BVDV 对母牛的影响不大，仍可受孕[32]。规模化养牛场，种公牛和母牛之间的主要传播途径为本交或人工授精[33]。若使用PI 种公牛自然配种，具有抗体的母牛（血清学呈阳性的母牛）能顺利受孕且产出健康的犊牛[34]。如果感染BVDV 的种公牛精液用于人工授精时，尽管多数血清学阳性的怀孕牛不会生出PI 牛，但多数没有BVDV 抗体的母牛将被BVDV 感染[35]。

BVDV 感染，病毒会潜伏在生殖腺和附睾内，因此，对于感染BVDV 后痊愈的牛，或者那些对BVDV具有免疫力的牛（血液中含有BVDV抗体的牛），即使血清学检测是阴性的牛，用作种用时仍需要检测精液是否含有BVDV[36-37]。虽然PI 种公牛通过精液排毒延长了排毒期，但一过性感染BVDV的种公牛从精液中排毒时间是在痊愈后10～14 d，而且一过性感染的公牛比PI 公牛的精液中BVDV 的滴度要低得多[38]。由此可见，种公牛感染BVDV痊愈后最好在半个月之后再留作种用，如果经济允许最好将其淘汰。

胚胎移植 胚胎移植是BVDV 在大型养牛场传播的一种途径，如果胚胎的接受者是PI 母牛，移植的胚胎将经过垂直传播成为PI 犊牛[39]。

污染物 PI 牛可以通过体液传染BVDV 给易感牛。使用给PI 牛抽过血的针头未经过任何消毒就直接给易感牛进行肌肉注射，便可以使易感牛感染BVDV[40]。若将经PI 牛使用过的鼻钳再给健康牛使用，便有机会使得健康牛感染BVDV。BVDV 也可能经过触诊套筒从PI 母牛传播给其他易感母牛[40]。

蚊虫叮咬 试验表明，蚊虫也可能传播BVDV。当50 只蜱蝇在持续性感染牛体表停留5 min 后，在15 min内叮咬未感染BVDV的健康牛，就可以完成BVDV的传播[40-41]。在实际生产中，应注意蚊虫的杀灭工作。

牛副产品 近年来，牛血清和生物制品中检出BVDV 污染的情况并不少见，其中进口胎牛血清和国产胎牛血清、小牛血清及猪瘟疫苗等生物产品均检出过BVDV 病毒的核酸或者抗原物质。其中，国产胎牛血清、含牛血清的细胞培养物和进口牛血清等牛副产品中检测出BVDV 的阳性率高达80%，以MDBK（牛肾细胞）细胞中检出BVDV 感染的概率最高，占80%以上。推测其最根本的原因可能就是培养细胞用的胎牛血清被BVDV 污染，从而导致了MDBK 细胞和其他易感细胞被BVDV 所污染[38-41]。

我国很多小型养殖户经常使用一些自家疫苗，优点是免疫效果良好、抗原特异性强、针对性强，但小养殖户由于操作或者检测消毒不规范，导致疫苗质量并不高，经常导致免疫失败，并可能导致牛群中出现BVDV 大规模流行，带来严重的经济损失。

采用疫苗接种、加强监测、淘汰持续感染和提高动物免疫力等综合措施是控制和根除BVDV 的最好手段。德国、瑞士、挪威、苏格兰等国家均已实现BVD 的净化，美国通过疫苗免疫也基本控制了BVD，其中部分地区开始逐步实施净化计划。

2.2.4 战略管理净化 BVDV 净化是一项长期的任务，应开展定期的BVDV 血清学监测，了解牛群感染与免疫状态、调整疫苗的接种方案，以期获得更好的免疫效果，全面提高牛场的防疫管理水平，严格控制生物制品的流入并及时控制其他呼吸道及繁殖类疾病，避免因牛的免疫力而成为BVDV 易感牛。

3 小结

牛病毒性腹泻病在我国流行广泛，主要原因是对牛BVDV的检测不严格，加上近几年养牛业的飞速发展导致活牛的流动增加。一些大型养牛场存在PI 牛，PI 牛是BVD 的最主要传染源。其中，PI 牛由于免疫缺陷更容易感染其他疾病，造成牛群内流行其他牛病。感染孕期母牛可造成母牛流产或者产下PI 牛。BVD所造成的经济损失不可估量，因此，对规模化养牛场BVD 牛的检测和净化是极为重要的。