哺乳动物早期胚胎发育调控的研究进展

赵向远，许保增

（中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林 长春 130112）

在哺乳动物的早期胚胎发育中，受精后的胚胎基因组激活（Embryo genome activation,EGA）是一个十分复杂的过程，需要细胞核和细胞质中一系列的分子调控机制，来确保两个亲本基因组可以在转录发生前进行重新编程和重组[1]。大量数据显示，某些基因在核重编程过程中如转录不当会对胚胎发育产生长期的不利影响。因此，准确控制EGA 的发生时间对胚胎发育有着至关重要的作用。在大多数哺乳动物中，基因组的激活是逐步进行的，这一发现对考虑调控这一过程的相关机制具有重要意义[2]。如小鼠的EGA可分为三个转变时期：①在1 细胞晚期，合子的基因组仅具有很微弱的转录活性；②在2 细胞早期（G1/S期）合成少量的蛋白质包括70 kDa 热应激蛋白（Heatshock protein）、TRCs（Transcription-requiring complexes）、U2afbp-rs 剪切因子（Splicing factor）及翻译起始因子—eIF-4C；③第二轮DNA 复制后的2 细胞晚期，开始合子基因激活的主要期，转录和翻译活性增加，导致蛋白质合成的形式发生巨大变化[1]。在其他哺乳动物中，早期胚胎基因激活的时间稍晚一些，发育过程中需要转录的时间也稍迟一些。通常，基因激活的主要期在第2～3 次卵裂后开始，如兔子、牛、恒河猕猴和人类的基因组激活事件主要发生在4～8 细胞阶段[2]。具体来说，有些基因在主要的基因组激活发生之前就已经被转录了，其中大多数管家基因被激活。而染色质蛋白含量的变化，特别是组蛋白和染色质结构的变化，能够调节基因组进行转录，并提供转录的特异性，基因增强子的转录也随着染色质结构的改变而激活[1]。在胚胎基因组转录激活的早期和后期阶段，转录因子的活性和蛋白质的合成也都是必不可少的，染色质结构的改变和转录因子活性能够为DNA 复制和裂解等过程提供一定的协调作用，这都是细胞周期依赖机制调控的结果[3]。在临床上，许多体外成熟的卵母细胞在受精后的不同阶段会出现发育停滞的现象，原因可能是基因变异，也可能是培养条件不合适[4]。因此，了解胚胎植入前胚胎发育能力的环境因素和分子调控机制，对于提高辅助生殖技术的成功率具有重要意义。

1 组蛋白修饰对哺乳动物早期胚胎发育的调控

组蛋白修饰在调控哺乳动物胚胎发育过程中对发育基因的表达具有十分重要的作用。在早期胚胎的基因组激活过程中，决定哪些基因可以转录以及何时转录的关键因素之一就是控制染色质结构的改变时间[5]。决定染色质结构的一个主要因素是与DNA 相关的组蛋白类型，核心组蛋白包括组蛋白H2A、H2B、H3 和H4，它们将DNA 组装成核小体[6]。其他的连接组蛋白，包括组蛋白H1 的多变体和其它特定的发育形式，与核小体之间的DNA 相连，并负责染色质的凝聚。而在发育过程中，不同的连接组蛋白与卵母细胞、早期胚胎和后期体细胞的染色质有关。在4 细胞阶段，第1个被鉴定的细胞间分子差异是组蛋白H3 精氨酸甲基化水平的差异，特别是R26 和17[7]，同时，高H3 甲基化水平与Nanog 和Sox2 表达的增加有关。在8 细胞阶段，一些细胞会表达更高水平的与TE 有关的特异性转录因子Cdx2[8]。连接组蛋白的这些差异影响了染色质结构，因为不同的连接组蛋白在它们与DNA的整体碱度和紧密度上有所不同，核心组蛋白与DNA的结合可以通过磷酸化和乙酰化来调控。其中，组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化减少了DNA 与核心组蛋白的接触，并通过其他DNA 结合蛋白进入DNA[9]。在小鼠体内，一种由早期卵母细胞编码的特异性组蛋白H1，从4 细胞发育到8 细胞阶段的表达下降。有研究报道，组蛋白H1 首次出现在4 细胞阶段[3]；也有研究称组蛋白H1 在胚胎的2 细胞期有表达，甚至在1 细胞期就开始表达。在后者的研究中，没有观察到与MII中期纺锤体相关的组蛋白H1 的表达，而是与两个原核有关[10]。在小鼠胚胎的1 细胞阶段，组蛋白H1 的合成是不依赖于转录的，且明显受卵母细胞编码mRNA 的驱动。组蛋白H1 在2 细胞阶段合成下降，然后在4 细胞阶段恢复，这与从卵母细胞编码的组蛋白H1转录本表达到胚胎转录本表达的转变相一致[11]。同样地，牛体细胞中组蛋白H1 直到8 细胞阶段才在早期胚胎中检测到。因此，早期胚胎中组蛋白H1 亚型表达的转变可能反映的是卵母细胞的需求，而不是表达早期胚胎的特定功能。

组蛋白表达的其他变化发生在胚胎发育的早期阶段。组蛋白 H2A 和 H3 的合成在1 细胞和2 细胞阶段上调，但部分受到-鹅膏菌素的抑制[12]。在这些阶段中，组蛋白H4 的合成对于基因转录而言是独立的。因此，尽管在1 细胞和2 细胞阶段，母体的转录本似乎完全负责H1 和H4 的表达，但胚胎基因组中也可能出现一些H2A 和H3 的表达，这可能有助于这些阶段中与基因组激活相关的染色质变化[13]。在体细胞中，组蛋白的合成是通过瞬时转录、翻译和随后的mRNA降解来调控和偶联到S 期[9]。相比之下，在1 细胞阶段，胚胎中组蛋白的合成除了胚胎组蛋白H2A 和 H3 基因的部分表达外，在很大程度上与S期不偶联，受母体mRNA募集水平的调控[10]，这种对母体编码mRNA的依赖为支持组蛋白在转录沉默早期转变提供了必要的机制。

2 细胞周期协调细胞质和核事件调控哺乳动物的早期胚胎发育

在利用mRNA 改变染色质结构和转录因子的阶段特异性合成来控制整个基因组激活的过程中，可能需要涉及染色质重组和组蛋白乙酰化的核事件和与蛋白质合成和翻译后相关的细胞质事件之间相互协调。但有研究认为这种协调并非基因组激活所必需的，因为基因组激活的时间仅由细胞质或核事件决定，而不是由两者共同决定[14]。但在这种情况下胚胎可能存在基因组激活不完全或不正确的风险。例如，如果基因组活化仅由核事件控制，缺乏细胞质对必需转录因子的控制可能导致早产[15]，然后通过正常蛋白质更新而过早降解，从而导致了这些转录因子的表达下降。相反，如果在核重编程之前激活转录因子并且建立精确的与基因调节相适应的转录抑制状态，那么严格的细胞质调控机制可能会在基因激活中发生错误[16]。

细胞周期是一个协调细胞质和细胞核事件的有效手段。例如，在S 期可以调节染色质结构的变化，同时细胞周期依赖性激酶可以调节关键转录因子和mRNA隐蔽、聚腺苷酸化或翻译因子的活性，从而影响母体mRNA 的翻译[3]。同时，细胞周期的进展确实会影响基因组的激活。例如，用DNA 聚合酶抑制剂阿非迪霉素（Aphidicolin）处理小鼠胚胎可降低1 细胞期的基因转录，同时也抑制了eIF-1A 基因的表达[18]。这些结果表明，第一轮的DNA复制可能促进基因组的激活，第二轮DNA 复制也对基因转录有一定的影响，许多基因在小鼠胚胎的2 细胞阶段表现出短暂的转录爆发，如Aphidicolin 能够在S 期阻止这些基因诱导的转录下调，并使在2 细胞阶段整体基因转录水平升高[18-19]。因此，第一轮DNA 复制是基因转录所必需的，也是创造转录抑制状态的第一步，第二轮DNA 复制完成了向转录抑制状态的过渡。

前两轮DNA 复制的抑制作用可能包括结合去乙酰化组蛋白、改变DNA 与核基质的偶联等其他特定变化。虽然这些变化在本质上是抑制转录的，但实质上它们是基因组激活的重要组成部分，因为它们可能提供正确调节转录基因的能力[20-21]。由于染色质结构的变化，可能仅仅是那些必需的转录因子有启动子的基因表达，虽然具有强启动子或增强子的基因会优先表达，但在这一过程中，许多其他基因也可能表达，尤其是在基础转录水平[22]。但转录的抑制状态会减少这些不必要基因的表达，而强启动子或增强子调控的基因将会持续表达，这对接下来的基因激活至关重要。

3 转录因子对基因组激活的影响

虽然早期胚胎染色质结构的变化在基因组激活中起到关键的作用，但单凭这些并改变并不能激活胚胎基因组的转录。在核转移之后，转录能力强的细胞核进行转录的能力取决于受体细胞质的发育阶段[23]。细胞质中的变化，尤其是转录因子的可用性、含量或是活性的变化在基因组激活中发挥同样重要的作用。例如，Hox是动物早期胚胎发育过程中的重要调控因子，在许多动物物种中，Hox 基因簇以共线性的方式控制着转录调控过程。在胚胎发育的第8.5 天，Hox 通过PRC1（Polycomb repressive complex 1）和 PRC2（Polycomb repressive complex 2）中的一组组蛋白修饰酶，结合甲基化组蛋白尾部的蛋白，在H3K4me3 处催化组蛋白H3 甲基化进行转录激活，控制脊椎动物身体轴的发育[24-25]。在果蝇中，转录因子Zelda 特异性地与合子基因最早的启动子结合，并启动它们进行激活，但目前还不清楚其他动物是否也有类似的现象[26]。研究表明，与哺乳动物多能性转录因子Oct4 同源的斑马鱼Pou5f1 在合子转录开始前就占据了SOX-POU的结合位点，并激活了最早的合子基因[27]。适当的RNA 聚合酶活性对转录激活十分重要。对大多数基因而言，RNA 聚合酶II 的羧基末端结构域（CTD）的过度磷酸化对转录激活是必需的[28]。在小鼠、家兔和非洲爪蟾中，CTD 在卵母细胞成熟过程中过度磷酸化，受精后不久磷酸化程度降低，然后在向2 细胞阶段过渡时磷酸化程度又增加[29]，这一磷酸化的改变可能与核定位的突然增加有关。因此，RNA 聚合酶II 磷酸化状态的改变可能是基因组激活的关键。

其他转录因子如Sp1、CBP、TBP和其他更特殊的转录因子，包括转录抑制蛋白在磷酸化状态发生了变化[30]。例如，在许多系统中，Sp1 的DNA 转录活性在卵母细胞成熟时因磷酸化而降低。但是在1 细胞阶段的G1 和G2 期观察到Sp1 的磷酸化水平增加，并在后期被激活[31]。有关转录因子的其他变化可能是启动子发生显著变化的基础，小鼠的eIF-1A基因在2 细胞阶段被诱导激活，但随后表达有所下降。在成熟的卵母细胞中，约70%的转录产物来自于近端含有TATA的启动子[32]。在基因组激活后，启动子发生了一个转变，即不含TATA 的启动子使用效率更高。在早期小鼠胚胎或胚胎干细胞中，启动子活性或增强子介导的转录激活不需要TATA 盒，但在卵母细胞中则需要含有TATA 的启动子有效表达[31,33]。启动子的这种变化可能反映了转录因子含量的差异，这使得卵母细胞有其特有的转录序列，并伴随着转录组激活相关基因的表达。

4 结论与展望

胚胎基因组激活作为哺乳动物胚胎着床前发育的重要阶段，主要事件是来自胚胎基因组表达的转录本取代了指导早期发育的母体转录本。虽然现在对早期胚胎发育的调控机制已经有了很多了解，但仍有很多问题目前尚未解决。蛋白质的合成和母体mRNA 的转录抑制虽然在基因组激活中发挥着重要作用，但我们对募集到的母体转录本序列及其编码蛋白所发挥的功能知之甚少，关于细胞周期的通路是如何调控这些mRNA 翻译的机制也不甚了解。近年来，随着生殖技术的发展和研究的进步，这些问题将很快得到解决。我们可以利用单细胞 RNA-seq 技术用于转录组定量分析，获得细胞分裂各阶段的重要标记，并应用相关的技术手段对早期胚胎发育过程中关键阶段的候选基因进行进一步的研究，以前所未有的广度和深度探讨这一过程中重要的分子事件，这必将为哺乳动物胚胎发育及生存和繁衍的调控提供新的理论依据和技术支持。