ZIP4 与肿瘤生物学行为的研究进展

朱婷婷 综述,周旋审校

（天津医科大学肿瘤医院颌面和耳鼻喉肿瘤科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津300060）

锌是人体必需的微量元素之一，参与生物体内多种生理活动，例如调节酶的活性，参与体内电子传递，调控基因表达等［1］。最新研究表明，锌对肿瘤的生长和转移起重要作用，因为锌是许多涉及血管生成、细胞增殖和癌细胞转移的酶的重要组成部分，也是许多金属酶的必要激活剂［2］。研究表明，缺锌可引起生物体内细胞凋亡，但高浓度的锌具有细胞毒性，因此机体进化出一套复杂的系统来维持锌浓度的稳态。这一过程主要依赖于两大基因家族编码的蛋白来实现：SLC39 编码的锌铁调控蛋白（ZRT，IRT-like protein，ZIP）蛋白家族和SLC30 编码的锌转运体（Zn Transporter，ZnT）蛋白家族。两者作用相反，ZIP 蛋白家族主要负责将锌离子从细胞外或细胞器（或囊泡）转运至细胞质中；而ZnT 蛋白家族则使锌离子自细胞质转运到循环血液或移入细胞器（或囊泡），两者共同维持细胞内外锌离子的稳态［3］，这对于维持机体正常生理活动起着至关重要作用。

在ZIP 家族的14 种跨膜蛋白中，仅发现ZIP4和ZIP5 在肠道上皮细胞中有表达。ZIP4 主要分布在十二指肠和空肠上皮细胞的顶端膜上，由8 个跨膜结构域组成，是锌进入肠道上皮细胞最重要的转运蛋白。ZIP4 在肠道上皮细胞中的表达和分布受肠道内锌量调节，当肠道中锌缺乏时，肠道上皮细胞中ZIP4 表达量明显增加，并且主要集聚在肠道上皮细胞的顶端膜上；相反，当锌摄入增多时，肠道上皮细胞中ZIP4 表达量减少，肠道上皮细胞顶端膜上ZIP4 表达量急剧下降，此时ZIP4 主要位于细胞质核周囊泡中［4］。有研究表明敲低ZIP4，会降低细胞内锌含量，导致与DNA 合成有关的脱氧胸苷激酶活性降低，细胞生长迟缓，免疫反应受损，伤口愈合变慢并阻碍骨骼发育［2，5］。

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1 ZIP4 表达紊乱与肿瘤关系密切

大量研究表明ZIP4 的异常表达与肿瘤的发生和转移有着密切关系［6-8］。Oncomine 数据库（http://www.oncomine.org）分析了多种恶性肿瘤中ZIP4 的表达，在淋巴瘤、胶质瘤、恶性黑色素瘤、胰腺癌、口腔鳞癌、卵巢癌、转移性结肠癌等多种恶性肿瘤中ZIP4 表达升高，且与肿瘤的恶性程度、临床分期相关［9-11］。但在前列腺癌中ZIP4 的表达量较正常组织明显减少，表现为抑癌基因的功能［12］。这些结果表明ZIP4 表达紊乱是恶性肿瘤的特异性分子标签之一。

分别对临床有效率和PCO2绘制倒漏斗图，见图8、9。结果显示纳入研究数据点基本分布在对称轴的两侧，且位于倒漏斗图的顶部，但临床有效率的个别数据点在倒漏斗图中下部、PCO2的个别数据点在倒漏斗图线边缘，提示可能存在发表偏移。

2 ZIP4 与肿瘤细胞周期

4.1.4 ZIP4 促进ECM 的降解 基质金属蛋白酶（Matrix metallopoteinases，MMPs）是一组能够降解ECM 的锌离子依赖型内肽酶。ECM 和基底膜的降解是肿瘤侵袭和转移的关键环节。Zhang 等［36］研究胰腺癌时发现ZIP4 过表达的异种移植瘤中，两种主要的MMP（MMP-2 和MMP-9）的表达比载体对照异种移植瘤组明显增加，MMP 是在癌细胞侵袭和转移中发挥关键作用的酶，表明ZIP4 可能通过MMP 途径促进胰腺癌细胞生长和侵袭。Xu 等［27］在肝癌的研究中也发现ZIP4 的过表达导致MMP-2 和MMP-9 的表达明显增加。因此，ZIP4 可以通过促进ECM 的降解促进EMT 发生。

3 ZIP4 与肿瘤细胞凋亡

4.1.2 抑制肿瘤细胞的转移能力 Zhang 等［32］在研究胰腺癌时发现，ZIP4/CREB 促进miR-373 转录并以“单击多靶”的方式调节TP53INP1、LATS2 和CD44 等基因表达。TP53INP1 是促凋亡应激诱导的p53 靶基因，其表达增加可以抑制肿瘤细胞生长［33］。LATS2 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，是在p53 介导的CDK 通路中起重要作用的肿瘤生长抑制剂［34］。CD44 是透明质酸的细胞表面受体，并且是乳腺癌、前列腺癌和结肠癌中的已知肿瘤转移抑制因子［35］。因此，ZIP4 可以通过下调TP53INP1、LATS2 和CD44影响胰腺癌细胞增殖、侵袭和转移能力，表明ZIP4-CREB-miR-373 信号转导通路可能参与促进胰腺癌细胞生长。

4 ZIP4 对肿瘤细胞侵袭转移的影响

4.1 ZIP4 促进肿瘤细胞发生EMT EMT 是促进肿瘤细胞侵袭、转移的一个关键因素。EMT 的特征是细胞失去连接和细胞极性改变，同时细胞获得间质表型和侵袭能力。E-钙黏蛋白（cadherin）表达的缺失是发生EMT 的主要诱因。一些研究表明ZIP4 可以通过解除细胞间连接结构，促进细胞肌动蛋白骨架重排，促进细胞外基质的降解等方式，促进EMT的发生，进而促进肿瘤细胞的侵袭、转移。

ZIP4 在肿瘤侵袭转移中起着重要作用。多项研究表明ZIP4 在肿瘤组织中的表达高于非肿瘤组织，ZIP4 表达与肿瘤迁移、侵袭、复发、Child-Turcotte-Pugh 评分、总生存期和无瘤生存期显著相关［27］。ZIP4促进肿瘤侵袭转移主要通过以下几种方式：促进肿瘤细胞发生上皮-间充质转化（EMT），主要包括解除细胞间连接结构，促进细胞肌动蛋白骨架重排，降解细胞外基质等；促进炎症介质的产生，增加血管通透性进而促进肿瘤细胞渗入血管及淋巴管；促进血管新生。

4.1.1 解除细胞间连接结构 ZO-1 和claudin-1 是防止癌细胞迁移的重要的细胞间连接蛋白。Liu 等［28］的最新研究表明，ZIP4 在胰腺癌细胞中以ZEB1 依赖的方式抑制ZO-1 和claudin-1 的表达，进而导致FAK 和Paxillin 的磷酸化，促进肿瘤的迁移和侵袭，而且ZIP4 抑制ZO-1 和claudin-1 的表达是独立于CREB 的调控。ZEB1 是锌依赖的转录因子，主要通过TGF-β、BMP、NF-κB 和Notch 等信号通路参与肿瘤细胞迁移和侵袭［29-30］。因此，在胰腺癌中阻断ZIP4-ZEB1-ZO-1-claudin-1-FAK-Paxillin 信号通路或许能为胰腺癌的治疗提供新的思路。Wu 等［31］在研究中发现敲低ZIP4 后可以诱导更多上皮样表型的表达，如E-钙黏蛋白表达升高，而一些间质表型指标如FSP-1 和N-钙黏蛋白表达降低，进而抑制EMT 的发生。

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多项研究表明减少肿瘤细胞中ZIP4 的表达可以通过不同信号通路来诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长［18］。生物体内细胞经典的凋亡方式是Bcl-2和caspase 通路，最常见的细胞凋亡方式是通过caspase 介导的［19-20］。Caspase-9 是内源性凋亡通路的上游启动子，可诱导下游caspase 信号通路级联放大［21］。Cui 等［22］研究发现，在低锌环境中，caspase-9/caspase-7/PARP 级联反应可以诱导细胞凋亡，而ZIP4 过表达可以抑制caspase-9 和caspase-7 裂解并阻断凋亡信号转导，进一步抑制PARP 的切割，从而减少细胞凋亡。细胞色素C 是caspase-9 的激活剂，Bax 和Bak 可以通过线粒体和内质网途径促进细胞凋亡［23］。ZIP4 过表达时细胞色素C 和Bax 下调，而ZIP4 沉默时细胞色素C 和Bax 表达升高，而Bak 表达没有差异，所以，ZIP4 很可能是通过细胞色素C和Bax 途径产生对凋亡的抗性。除了由caspase-9诱发的内在信号转导途径外，凋亡信号转导中的其他关键参与者，例如由caspase-8 启动的TNF 途径［24］和由凋亡诱导因子（AIF）介导的半胱天冬酶非依赖途径［25］，可能也参与ZIP4 介导的细胞凋亡的抗性。在头颈部鳞癌的一项研究中，证实激活的EGFR 可以通过IL-6/JAK/STAT3 信号通路上调PD-L1 的表达。用表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）处理细胞可以下调IL-6/JAK/STAT3途径的活化，进而减少PD-L1 的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡［26］。Xu 等［27］研究表明ZIP4 可以抑制凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、BAX 的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，抑制肝癌细胞凋亡并促进肝癌的进展。因此，降低肿瘤细胞中ZIP4 的表达可以诱导肿瘤细胞凋亡。

4.2 促进炎性介质的产生 在肿瘤侵袭模型中，肿瘤细胞产生的炎性介质IL-1、TNF-α 及IL-6 主要是通过NF-κB 和STAT3 途径促进MMPs 表达，影响癌细胞的侵袭性和转移能力。Zhang 等［15］研究表明ZIP4 过表达引起CREB 磷酸化，IL-6 分泌增加，进而激活STAT3 并导致cyclin D1 表达增加，导致胰腺癌中细胞增殖和肿瘤进展。Li 等［38］研究表明在胰腺癌细胞中敲低ZIP4 的表达时，NF-κB 的活性明显降低，表明NF-κB 也可能参与ZIP4 沉默诱导的胰腺癌细胞生长抑制。NF-κB 是肿瘤相关炎症的重要调节因子之一，可以诱导转录因子snail 和Twist转录，进而促进肿瘤细胞的EMT［39］。

4.1.5 ZIP4 促进肿瘤细胞获得抗衰老、抗凋亡抗性 Fan等［37］在卵巢癌研究中表明敲低ZIP4 会降低卵巢癌细胞的失巢凋亡抗性和集落形成活性、球体形成活性和耐药性等肿瘤干细胞相关活性。说明ZIP4 可以通过增加肿瘤干细胞相关活性促进EMT 发生。

来自多个不同研究小组的研究表明，敲低ZIP4可以通过阻滞G1/S 期的细胞周期进程来抑制肿瘤细胞增殖［11-14］。Ishida 等［11］进行细胞周期分析时发现，敲低ZIP4 后，G1期细胞数明显多于对照组，证明敲低ZIP4 可以使细胞周期被阻滞在G1期从而抑制细胞增殖。同时发现，敲低ZIP4 后，CDKIs 表达升高，细胞周期蛋白D1（cyclinD1）、细胞周期蛋白E（cyclinE）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK2）、CDK4 和CDK6表达减少。有研究显示，ZIP4 在胰腺癌中通过激活白细胞介素（IL）-6/信号转导与转录激活因子（STAT）3 信号通路来调控肿瘤细胞的生长，其通过CREB引起IL-6 表达增加，IL-6 又激活STAT3 并导致cyclin D1 表达增加，进而导致胰腺癌细胞增殖和肿瘤进展。Cyclin D1 是G1/S 期转化的关键细胞周期调控蛋白［15］，cyclin D1与CDK（CDK4 或CDK6）的结合导致成视网膜细胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，E2F 被释放、活化，解除了S 期所需要基因的转录阻断，细胞由G1期向S 期转化［16］。E2F1 的转录靶点包括细胞周期蛋白（如CDC2、CDC25A、cyclin D1 和cyclin E）与DNA 复制和（或）DNA 修复所需的蛋白（如DHFR、DNA 聚合酶α，RCF3 和Rad52E），这些蛋白都是细胞周期G1/S 期转换至关重要的蛋白［17］。因此，敲低ZIP4 时，cyclin D1 表达会减少，继而影响E2F1的表达，从而导致细胞周期阻滞。

其次，构造各单层次判断矩阵，采用问卷调查的方式收集判断矩阵的数据。调查对象包括在制造业升级研究领域较为权威的专家、学者和山东省相关产业政策研究部门的工作人员。通过综合考虑相关调查人员的打分情况，构造出层次判断矩阵，对应表1，各个层次判断矩阵分别用A、A1、A2和A3来表示。

4.1.3 促进肌动蛋白骨架重排 Liu 等［28］发现ZIP4可导致FAK 和paxillin 的磷酸化。FAK 在整合素和RTK 介导的信号转导中起核心作用，并在细胞骨架变化、板状伪足形成和细胞增殖和运动中起关键作用。Paxillin 是细胞外基质（ECM）和肌动蛋白细胞骨架之间联系的桥梁［14］，酪氨酸磷酸化对于paxillin 促进肿瘤细胞的侵袭性是必需的。因此，ZIP4 可以通过促进FAK 和paxillin 的磷酸化进而促进肌动蛋白骨架重排，促进EMT 的发生。本课题组通过比较用不同浓度锌离子处理和过表达ZIP4 的Detroit562细胞和Fadu 细胞中细胞骨架F-actin 形态学改变，发现高浓度锌离子处理组中肿瘤细胞侵袭性伪足数量明显增加，F-actin 由原来卷曲型纤维转变为应力型纤维，这提示ZIP4 过表达可以促进HNSCC 细胞骨架重塑，增加细胞的侵袭能力。

4.3 ZIP4 促进血管新生 神经纤毛蛋白（NRPS）是Ⅰ型跨膜糖蛋白，一些研究表明，NRPS 在肿瘤生长和血管生成中起重要作用，并有可能作为预测前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌的进展的生物标志物。Zhang等［36］发现ZIP4 过表达的胰腺癌异种移植瘤中神经纤毛蛋白-1（NRP-1）、血管内皮生长因子（VEGF）表达升高，这表明ZIP4 介导的胰腺癌细胞生长可能与其促血管新生有关。

5 ZIP4 与肿瘤细胞化疗耐药

Li 等［38］研究发现在胰腺癌细胞中敲低ZIP4 的表达时，NF-κB 的活性明显降低，cyclin D1 表达也明显降低，继而导致化疗药物（如顺铂和氟嘧啶）的肿瘤生长抑制作用增强。研究表明NF-κB 信号通路与胰腺癌产生化疗耐药性密切相关，其可以通过诱导抗凋亡bcl2 蛋白的表达来促进癌细胞产生化疗耐药［17，20］。因此，在cyclin D1 过表达细胞中观察到NF-κB 活化增加可能反过来上调抗细胞凋亡蛋白的表达，最终保护细胞免于凋亡。Biliran 等［40］研究发现，在Ela-myc 胰腺肿瘤细胞系中过表达ZIP4 会上调cyclin D1，使得肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性，相反，敲低ZIP4 后，cyclin D1 表达减少会导致对顺铂诱导的凋亡的敏感性增加。这些研究表明ZIP4 影响cyclin D1 的表达后，参与了胰腺癌化疗耐药，这也是胰腺癌中ZIP4 升高可能会产生不良预后的原因之一。Wu 等［31］研究也证明了ZIP4 增强了非小细胞肺癌细胞对顺铂治疗的抗性。因此，ZIP4 可以作为肿瘤化疗耐药的重要预测分子和逆转肿瘤化疗耐药的候选靶点。

第三，被信任和认可的优势。被信任和认可，不仅体现在养老服务的专业化方面，还体现在个人信息安全是否得到保障等方面。基于区块链技术的智慧养老服务模式的构建，所有的养老服务数据都是被加密的，用密码学的方式方法保证了数据的获取权限，以及数据的完整性、连续性和一致性，智慧养老服务平台的安全性得到了保障。同时，智慧养老平台会对服务对象的全部生物信息数据进行清晰地记录，确保平台数据的及时性。平台数据的安全性和及时性，树立了智慧养老服务模式的专业性，整体上提升了服务受益群体对智慧养老服务模式的信任和认可度。

6 ZIP4 与肿瘤患者预后相关

Xu 等［27］研究表明ZIP4 与肿瘤复发、肿瘤大小、TNM 分期和CTP 评分相关。ZIP4 表达高的患者具有更高的复发率和更短的生存时间。因此，ZIP4 高表达可以作为肝癌后肝移植总体存活率的独立且有效的预后因素，可以作为一个新的治疗靶点和肝癌后肝移植合适的预后标志物。Lin 等［9］研究表明与ZIP4 表达水平显著相关的基因主要是转录因子如锌指蛋白、DNA 或RNA 结合蛋白，它们高度参与细胞侵袭和血管生成，并且与患者的生存率呈负相关。ZIP4 表达与胶质瘤患者的肿瘤分级和临床结果显著相关，可能成为胶质瘤患者有希望的生物标志物。

综上所述，ZIP4 在多种肿瘤细胞的增殖、细胞周期演进与侵袭转移等方面都发挥着重要作用，这使得ZIP4 可能具有成为预测肿瘤进展、复发与转移的重要分子标志物的潜能。因此需要进一步研究ZIP4与肿瘤发生、发展的关系以开发新型肿瘤治疗方法。