食源性致病菌活的不可培养状态检测方法研究进展

刘锦涛，夏 静，喻志学，赵喜红

（武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉 430205）

1 VBNC状态食源性致病菌介绍

活的不可培养状态（Viable but non-culturable state，VBNC状态）指细菌处在不利于自身生长繁殖的条件下，所表现出的一种特殊存在方式，是细菌为了延续生命而采取的一种特殊的生存策略。当细菌处于活的不可培养状态时，其细胞体积会减小，在常规的平板上培养时，由于细胞失去了可培养性，故不能在平板上长出正常菌落。但细菌细胞仍具备代谢活性和生命活动，并在适宜其生长繁殖的环境下可以恢复到能够培养的正常状态即复苏，故处于活的不可培养状态的细菌仍具有致病性。1982年，徐怀怒研究团队第1次很明确提出了活的不可培养状态（VBNC状态）这一概念[1]。这一概念是来源于对霍乱弧菌和大肠杆菌在遭到低温胁迫时会进入仍然具有活性的“休眠”状态的发现，这一概念的提出使人们意识到在世界范围内霍乱病的周期性发生可能与霍乱弧菌的VBNC状态有关系。继徐怀怒等人提出活的不可培养状态这一概念后，又有许多已知的细菌被报道可以进入活的不可培养这一细菌存在的特殊状态[2]，迄今为止，已知有68种细菌都可进入活的不可培养状态，其中大部分为人类致病菌，并且大多数人类致病菌进入活的不可培养状态后仍然保持有一定的毒性，在适宜其生长繁殖的环境中可以被复苏[3]。E.coli O157∶H7作为食源性致病细菌中的一种，能够通过各种途径传播，如人类生存所必需的水源和食物等，其中食物传播的主要是由于食品在加工制作过程中加热不充分或温度不够高等原因所导致。除此之外，在食品加工过程中极端的温度（如巴氏消毒、低温保藏）、辐射（紫外消毒、远红外辐射、微波辐射、电离辐射）、干燥、高压等因素易诱导E.coli O157∶H7的活的不可培养状态的形成。

目前，关于诱导细菌进入活的不可培养状态的机理尚不太明确，主要有3类假说[4]：一是细菌在不利于自身生长繁殖的环境中生存时，导致细菌细胞内一些使细胞程序性死亡的相关基因被环境胁迫作用激活，从而使细菌细胞不可培养，进入VBNC状态，细菌得以在不良的环境中存活下来[5]。另一种是“细胞衰退学说”，一些学者认为，细菌细胞在不利于自身生长繁殖的环境中生长时，不良的环境作用会导致细胞内氧化，使细菌菌体受到损伤，生长衰退，从而使细菌细胞变成不能够被培养的状态。这种不能够被培养的状态能否恢复为能够被培养的状态，取决于细胞受伤害的深浅程度。若细胞损伤程度不大，则细菌最终在适宜的环境中可培养性会恢复。还有一些学者认为，细菌活的不可培养状态的形成是类似于孢子的形成，是正常的细菌处于不利于自身生长繁殖环境中时，所表现出的一种休眠状态，从而保证其能够在不利于自身生长繁殖环境中存活下来[6]。

可以被复苏是VBNC状态致病菌重要的特征之一。当把导致细菌进入VBNC状态的不利于自身生长繁殖的环境胁迫作用除去后，细菌的代谢活性和其可培养性会随之恢复[7]。由于处于活的不可培养状态的细菌不能在固体培养基上形成正常的菌落，导致传统的平板涂布法（PC法）难以检测出VBNC状态的细菌，容易造成细菌检测结果偏低，使人们低估细菌的危险。对于许多活的不可培养状态的食源性致病菌来说，可能不会表现出致病性，但VBNC状态的食源性致病菌在适宜条件下其可培养性仍可以复苏并能够表现出致病性，因此VBCN状态的食源性致病菌会给食品安全带来潜在的不可控风险[8]。因而，对食源性致病菌VBNC状态的研究具有重要意义。

2 VBNC状态食源性致病菌的检测方法

常规的检测方法无法检测到不可培养状态的细菌，就容易忽略处于活的不可培养状态的食源性致病菌，构成食品安全和公共卫生行业的潜在威胁，只有找到针对活的不可培养状态食源性致病菌快速有效的检测方法才能够解决这一问题。目前针对活的不可培养状态食源性致病菌的检测方法，主要包括分子生物学检测法、免疫学检测法和光学检测法。这3种方法主要是对细菌的活菌数和总菌数进行快速有效的检测，再联合PC法得到细菌的可培养数，从而能够检测出是否有活的不可培养状态的细菌存在。利用分子生物学的方法，能够通过分析比较处于正常状态的细菌与活的不可培养状态的细菌在某些已知基因的表达上差异，从而判断细菌是否进入活的不可培养状态。

2.1 分子生物学法

因为分子生物学检测法具有高效、快速、灵敏度高和特异性强等优点，所以采用分子生物学的方法检测和分析活的不可培养状态的细菌，已经成为目前实验室检测VBNC状态细菌强有力的经常用到的手段。如今，采用分子生物学方法检测VBNC状态细菌主要是将一些DNA的核酸染料（如EMA和PMA） 与核酸分子扩增技术如聚合酶链式反应（PCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 和环介导等温扩增（LAMP）反应等相结合的检测办法进行检测。

核酸染料PMA与EMA是对DNA分子具有很好亲和性和选择性的2种荧光染料。当细菌细胞处于正常状态时，由于具有完整的细胞膜结构，这些染料不能够透过正常的活细胞膜和DNA分子进行结合的；当细菌细胞的细胞膜和细胞壁破损后，这些染料便能够进入细胞和DNA分子进行结合，导致DNA分子不能被扩增，因此可以利用此类核酸染料与PCR反应、qPCR反应及LAMP反应等分子反应技术相结合，对活菌、死菌进行检测[9]。

由于细菌的正常生长繁殖过程中其遗传信息的转录和翻译是同时发生的。故在细菌细胞中还未结束信使RNA的合成时，蛋白质的翻译就已经开始了。并且，绝大多数的细菌所产生的信使RNA的稳定性极差，通常是翻译结束其降解就随之开始，半衰期较短。因此，信使RNA存在与否，就可以用于判断细菌是否存活[10]。另外，在同种微生物的不同状态之间或者在不同微生物之间，总是会存在着一些差异基因，因此可以通过提取细菌细胞中的总RNA后，再采用一些核酸分子扩增技术（如RT-qPCR技术）对这些差异基因进行定量检测，用来判断VBNC状态的信使RNA的相对表达程度，从而能够准确评价VBNC状态细菌对人类健康和食品卫生存在的潜在威胁。Liu Y等人[11]利用逆转录PCR与实时定量PCR相结合的技术对处于活而非可培养状态的E.coli O157∶H7进行研究，结果发现活的不可培养状态的细胞中存在1/10的细胞中含有拷贝rpoS mRNA，实现了定量检测活的不可培养状态的细菌。若能找到表达较为稳定的参照基因，也能实现对处于不同状态的细胞（如可培养状态细胞、不可培养状态的细胞及死细胞等）进行定量的检测。

2.2 免疫学法

免疫学的方法是利用抗原与抗体的特异性结合来对活的不可培养状态的细菌进行检测的一种方法。能够利用免疫学方法对其进行检测是由于处于活的不可培养状态细菌的细胞壁表面仍然存在和正常状态的细菌相同抗原，可以与相对应的特异性抗体结合，从而能够完成免疫反应[12]，故可以将免疫学法与荧光染色法结合，实现对活、死细胞的检测，再结合平板计数法（PC法）检测出具有可培养能力的细胞的数量，快速检测出活的不可培养状态细菌。免疫学法常用的有间接免疫荧光法（IF） 和酶联免疫吸附法（ELISA）。这2种方法各有优缺点，间接免疫荧光法具备耗时短、检出限低、灵敏度高及在荧光显微镜下可直接观察到细菌菌体完好无损细胞膜的特点；酶联免疫吸附法则具有操作简单、特异性识别的能力强和抗干扰能力强等特点。间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法常用来检测细菌的总菌数，然后再联合异养菌平板计数法（HPC法）和荧光染色法得出活的不可培养状态细菌数。

2.3 光学法

光学方法主要是使用荧光显微镜将样品用荧光染料染色后进行镜检，现在常用的是活菌镜检直接计数法（DVC法）。

在1979年，由Kogure K等人[13]首次提出了活菌镜检直接计数法（DVC法），能将活菌与死菌快速区分开，至今仍然是一种实验室常用的方法。在培养基中，有活性的细菌依然能够吸收营养物质，故DVC法就是在培养基中加入萘啶酮酸与细菌细胞中的DNA发生交联作用来抑制细胞中DNA的合成，从而使活细胞失去分裂能力；在适当温度下培养6 h后，细菌菌体会增大变粗，然后再用吖啶橙荧光染料染色法进行染色，即可在倒置荧光显微镜下观察到伸长变粗的细菌菌体即为有活性的细菌细胞，将活细胞与死细胞区分开来。但活菌镜检直接计数法中所加的DNA合成抑制剂（萘啶酮酸）只能抑制大多数G-菌株的DNA合成，而对大多数G+菌株及少量的G-菌株无能为力，一些比较重要的食源性致病菌中也有G+菌株，如Listeria monocytogenes、Clostridium botulinum、Bacillus cereus及 Staphylococcus aureus等。故有研究表明，将活菌镜检直接计数法中的核酸抑制剂萘啶酮酸使用氧氟沙星或者环丙沙星代替，同时用10%的大豆蛋白胨代替酵母膏，能够有效抑制大多数G+菌株和G-菌株DNA合成，从而扩展传统活菌镜检直接计数法的检测范围[14]。在活菌镜检直接计数法中除了能够添加一些常见的DNA抑制剂外，还可以添加一些电子受体络合物（CTC）进行镜检。无色氧化态的CTC可以透过细胞膜，进入活细胞中参与细胞内的氧化还原反应，从而被还原成红色或者紫色，故DVC-CTC法就是利用活菌还具有氧化还原能力，加入CTC后可以在荧光显微镜下进行活菌直接计数。有研究报道，DVC-CTC法所能够检测的活菌数比原始的活菌镜检直接计数法高出1～2个数量级，故DVC-CTC法相比于原始的活菌镜检直接计数法来说具有更高的准确性[15]。

2.4 其他方法

目前还有其他的一些检测方法能够用于活的不可培养状态的细菌检测，如流式细胞仪检测、同位素标记法、酶分析、基因芯片检测、DNA指纹图谱技术及多种方法相结合的综合应用检测等[16]。

3 结语

民以食为天，食以安为先。有关食源性致病菌活的不可培养状态的发现和研究，对于微生物学、公共卫生学、预防医学和食品卫生检验等方面都有重要意义，特别是对提高食品安全性、保障人体的健康有重要意义。活的不可培养状态细菌的存在给食品安全带来了潜在的威胁，解决这一威胁的根本办法就是建立针对VBNC状态细菌的快速检测方法及完善的检测机制。随着科学水平的不断发展，人们会对VBNC状态研究越来越多，各种先进的仪器设备也会帮助人们更加深入地了解VBNC状态形成的分子机制。在以后的研究中通过转录组学和蛋白组学的联合分析，研究VBNC状态形成机制和复苏机制可能是未来食源性致病菌VBNC状态研究的一个热点。