蜂毒肽抗肿瘤作用研究进展

冯 挺，胡福良

（1.浙江大学医学院临床医学1801 班，浙江 杭州 310058；2.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058）

1 引言

蜂毒取自蜜蜂(Apis)工蜂的毒腺以及副腺，为多种蛋白质多肽类、生物胺类和非蛋白物质组成的混合物。其中约占蜂毒干重的50%的蜂毒肽（Melittin） 是蜂毒中的重要活性成分。根据部分C-末端氨基酸残基所存在的差异，可将蜂毒肽分为蜂毒肽-1 和蜂毒肽-2 两种类型。其中蜂毒肽-1 由26 个氨基酸残基构成，分子式为C131H229N39O31，分子量为2.84 kD[1]。

蜂毒肽-1 构成成分中，赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸比例较大，所占比例为23.1%。进一步作蜂毒肽等电点测定可确定其pI＞7[2]。此外，蜂毒肽具有的两亲性主要来自于多肽链中特定的氨基酸排列顺序，即非极性、疏水性以及中性氨基酸主要集中于N-末端，而亲水性和碱性氨基酸则大部分位于C-末端。在水溶液中蜂毒肽由于单体空间位阻所限，往往趋于形成以四聚体为主的寡聚体。就功能而言，蜂毒肽具有潜在膜活性，其寡聚体可在细胞膜上形成亲水性小孔干扰磷脂双分子层的完整性，使胞内物质渗漏造成渗透压改变，继而导致细胞组织的溶解。研究发现蜂毒肽浓度与其同体细胞结合能力在一定范围内呈正相关关系，高浓度四聚体的蜂毒肽具有较明显的细胞杀伤作用。由于蜂毒肽无序蛋白具有自发组装四聚体的物化性质以及其独特的作用机制，在临床具体应用中蜂毒肽表现出具抗菌、抗感染、抗肿瘤、抗病毒等生理效应，其中抗肿瘤作用更是成为近年来研究热点。

2 蜂毒肽抗肿瘤机制

蜂毒肽抗肿瘤作用的具体机制主要表现在对肿瘤细胞的直接杀伤效应，诱导肿瘤细胞发生损伤和凋亡，影响肿瘤细胞的生物学行为，改变肿瘤细胞生存环境和免疫调节作用等方面，以下分点论述。

2.1 直接杀伤肿瘤细胞

2.1.1 直接形成胞膜孔隙溶解细胞

中性水溶液中蜂毒肽主要以随机卷曲的单体形式存在[3]，在环境体系中pH 值上升以及相应离子比例改变的情况下，蜂毒肽即发生交联反应，最终形成螺旋状四聚体形态。研究发现，蜂毒肽高级结构具低稳定性，即高度无序性，其在不同溶液中多肽本身内部结构存在相当差异性，此为固有无序蛋白的显著特征。该差异可能为蜂毒肽对肿瘤细胞广谱性杀伤作用提供结构基础。且如上文所述蜂毒肽N-末端主要为非极性、疏水性以及中性氨基酸，C-末端为亲水性氨基酸以及碱性氨基酸，具有两亲性。该特征决定了蜂毒肽能插入天然或人工合成的磷脂双分子层，从而产生强烈的细胞毒素作用。且蜂毒肽可通过垂直构象与平行构象2 种不同形式与生物膜结合。垂直构象下蜂毒肽将导致孔隙形成，而水平构象下由于增大膜无效面积，反而阻止其他蜂毒肽表现为垂直构象。目前相关主流观念认为蜂毒肽相对浓度决定蜂毒肽的具体作用机制，即在低浓度下蜂毒肽主要以平行构象的形式与生物膜结合，在高浓度下蜂毒肽主要以垂直构象的形式与生物膜结合，即两步结合模式。但在分子动力学上蜂毒肽如何克服平行构象转变为垂直构象相关能阈尚需做进一步研究。

2.1.2 水解肿瘤细胞膜蛋白杀伤细胞

研究发现蜂毒肽对PLA2 作用具有双重性，在低浓度条件下蜂毒肽抑制PLA2 活性，而在高浓度条件下蜂毒肽则会激活PLA2。且蜂毒肽与PLA2 与肿瘤细胞相互作用后，会水解失活肿瘤细胞膜蛋白Band-3 蛋白[4]。Band-3 蛋白作为肿瘤细胞膜蛋白的重要组成部分，是肿瘤细胞膜上的重要离子通道，主要起到维持肿瘤细胞渗透压内外平衡的作用。除此之外，Band-3 蛋白尚具有维持细胞独立性与防止膜蛋白被错误水解的重要功能。当Band-3 蛋白异常水解后，肿瘤细胞膜内外离子交换代谢活动将发生紊乱，将影响肿瘤细胞整体渗透压平衡以及细胞生化代谢反应强度，肿瘤细胞长期失代偿后即发生细胞凋亡。

2.2 诱导肿瘤细胞凋亡

蜂毒肽尚可通过诱导肿瘤细胞凋亡的方式实现抗肿瘤作用，具体机制主要包括线粒体凋亡，死亡受体途径以及影响钙离子分布等。

2.2.1 线粒体凋亡途径

细胞凋亡可根据凋亡因子的来源分为外源性细胞凋亡和内源性细胞凋亡，其中内源性细胞凋亡主要效应器为线粒体，在接受相应损伤信息刺激后线粒体可释放出CytC 等凋亡因子[5]，进而激活细胞内与细胞凋亡密切相关的胱天蛋白酶 caspases-9，而后caspases-9 会激活下游级联反应，并以正反馈形式促进CytC 释放，实现快进程的内源性细胞凋亡。研究发现不同浓度蜂毒肽对肿瘤细胞的损伤程度也不同，高浓度的蜂毒肽往往直接造成对肿瘤细胞的杀伤效应，低浓度的蜂毒肽则主要通过上调某些损伤刺激程度来诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。李玉梅[6]等研究发现蜂毒肽能够上调人成骨肉瘤细胞U2OS 细胞抗凋亡蛋白Bcl-2 相关X 蛋白Bax 蛋白基因表达水平，Bax/Bcl-2 比例的增加将依次激活内源性细胞凋亡相关蛋白酶caspases-9 与caspases-3的活性，并提高线粒体膜通透性转换孔（mPTP） 通透性，肿瘤细胞离子平衡发生紊乱进而膜电位发生去极化，最终诱导人成骨肉瘤细胞U2OS 细胞凋亡。

2.2.2 死亡受体途径

死亡受体主要可分为活化诱导的CD95（Fas 或APO-1）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosisfactor，TNF） 和凋亡诱导配体受体TRAILR 三类。当胞外对应的凋亡刺激传递至体细胞细胞膜表面对应的跨膜死亡受体后，跨膜死亡受体会将凋亡信号先后由衔接蛋白与效应蛋白传至胞浆内，并激活相应的细胞凋亡机制，最终诱导细胞发生凋亡。张晨[7]用浓度为32μg/mL 的蜂毒肽处理人肝癌BEL-7402 细胞后，通过RT-PCR 扩增技术进行蜂毒肽与细胞凋亡相关蛋白基因表达谱之间相关性分析，发现蜂毒肽可上调凋亡相关蛋白Fas 蛋白表达以及其配体FasL 基因表达水平，增强肿瘤细胞死亡受体易感性，并促使肿瘤细胞发生凋亡，从而阻止肿瘤细胞的恶性增殖。且Wang等[8]通过构建小鼠荷瘤模型，发现5μg/mL 蜂毒肽便可激活CaMK II-TAK1-JNK/p38 以及抑制IκBα Kinase-NF-κB 的协同效应，该协同效应提高了肿瘤细胞对TRAIL 的敏感性并诱导肿瘤细胞发生凋亡。而JO 等[9]研究发现适当浓度蜂毒肽可有效抑制人卵巢癌细胞SKOV3 和人类卵巢畸胎瘤细胞(PA)-1 的增殖，具体机制则为其通过上调死亡受体(DR)表达以阻止细胞恶性增殖。

2.2.3 影响钙离子分布

钙离子作为人体细胞各种信号转导功能的中心离子，对细胞各项信号通路以及生命活动均具有关键性的调节功能。生理情况下细胞通过上游各种复杂机制调节钙泵与钙离子通道的活性，从而影响细胞内外钙动态平衡。但在异常情况下可能会产生钙超载的相关效应，如当Ca2＋从内质网中被释放进入细胞质后会激活内质网附近的calpain[10]，然后作用于caspases-12使之活化并释放入细胞质，从而导致细胞结构功能损伤以致细胞凋亡。CHU 等[11]研究发现在人骨瘤细胞MG63 中蜂毒肽能提高L 型Ca2＋通道通透性并诱导胞外Ca2＋内流，升高细胞内Ca2＋浓度，激活细胞内钙超载反应体系，诱导人骨瘤细胞MG63 发生细胞凋亡。且由蜂毒肽引起的Ca2＋内流与PKC 和PLA2活性并无直接相关性。

2.3 影响肿瘤细胞行为

恶性肿瘤细胞主要生理性行为即为浸润性生长以及扩散转移，其间伴随着一系列多步骤、多因素、多阶段的复杂相互作用，如细胞的脱落和聚合，黏附与去黏附等过程。蜂毒肽可能在其中多环节具体负性调控作用。

李绍祥等[12]研究发现蜂毒肽基因转染人肝癌细胞HepG2 后HepG2 细胞中CD54 表达水平明显下调，CD54 为细胞表面重要黏附受体，在大多数肿瘤细胞内异常高表达。CD54 具有协助肿瘤细胞逃脱T 细胞的免疫监视，以实现肿瘤细胞回避机体细胞免疫系统攻击，从而表现出肿瘤的高存活性与高转移性。故CD54 表达水平下调可抑制肿瘤细胞的扩散以及恶性增殖。PARK 等[13]通过研究蜂毒肽与人乳腺癌细胞MCF-7 细胞中NF-κB 和JNK/ p38 信号通路活动强度分析，证明蜂毒肽对该体系存在负性下调作用，该作用可影响基质金属蛋白酶-9（MMP-9） 的表达水平。后者往往与肿瘤细胞细胞外基质的降解以及肿瘤浸润性生长和远端转移的概率密切相关。Liu 等[14]研究表明，8μg/mL 蜂毒肽能有效抑制Jun 通路，而后者为肝癌细胞MHCC97L 获得浸润及迁移能力所必须的Ras 相关的C3 肉毒素底物(Rac)-1 依赖性通路的关键依赖通路，故其可通过下调Jun通路活性以最终达到阻止肝癌细胞转移的生理作用。

2.4 改变肿瘤细胞生存环境

原发性肿瘤在直径达到1～2 mm，若无新生血管生成以供给营养，常生长停滞，表明血管生成对肿瘤发生具有根本性影响，此外血管形成也为肿瘤细胞血道转移提供重要途径。研究发现蜂毒肽可有效减少骨肉瘤UNR-106 细胞裸鼠移植瘤新生血管数量，并改变骨肉瘤UNR-106 细胞细胞外基质成分。此外PARK等[13]研究发现蜂毒肽对血管内皮生长因子A诱导Lewis 肺癌体内肿瘤的生长和肿瘤相关血管的生成具有抑制作用，这种抑制效应可能与VEGF-2 和COX-2 通过促分裂原活化的蛋白激酶信号通路有关。

2.5 免疫调节作用

免疫调节是指在机体免疫系统整体作用下，在免疫器官、免疫细胞以及免疫分子三级间相互作用共同调整免疫反应，使机体能维持较高水平的免疫应答强度，保证正常的免疫清除和免疫监控功能。异常的免疫调节往往是绝大多数肿瘤逃脱机体免疫监视的主要原因。NAM 等[15]研究发现，蜂毒肽能上调T-bet 水平并选择性地诱导Th1 细胞谱系发展，终效应为增加Th1 细胞的特异性细胞因子γ-干扰素的表达。且蜂毒肽该效应无需依赖任何抗原呈递细胞即可完成CD4+T 细胞诱导。γ-干扰素则为细胞免疫体系的重要调节因子，具有极强的抗肿瘤作用。熊浪平等[16]研究发现蜂毒肽能调整Th1 细胞活性和增加机体内γ-干扰素浓度，并减少IL-4浓度，综合多种细胞因子的改变最终实现增强机体抗肿瘤效应。朱萱萱等[17]则通过不同浓度蜂毒皮下连续给药S180 肉瘤鼠5 d 发现其在增强T 淋巴细胞活性的基础上可增强网状内皮系统RES 单核巨噬细胞系统的吞噬功能，以实现对肿瘤细胞的杀伤作用。

3 结语与展望

蜂毒肽集抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗辐射等多种药理学作用于一身，被广泛应用于治疗血液及心血管系统疾病和神经系统疾病等方面。此外，据报道在农业领域也有所运用，为重要的医药开发节点。具体而言，如在抗肿瘤领域，蜂毒肽可通过对肿瘤细胞的直接杀伤效应，诱导肿瘤细胞发生损伤和凋亡，影响肿瘤细胞的生物学行为，改变肿瘤细胞生存环境和免疫调节作用等途径实现其生理活性。但蜂毒肽在投入临床实际应用前尚存在许多问题，如蜂毒肽分离提纯纯度较低，蜂毒肽本身具一定的溶血性问题等。当前前沿研究砥砺于改进色谱法，由粗蜂毒中提取蜂毒肽以及生物工程技术利用酵母表达体系，以及大豆发根细胞表达蜂毒肽效率，如莫伟亮[18]等通过将萤火虫荧光素酶和蜂毒肽融合蛋白通过发根农杆菌K599 介导入大豆发根细胞并表达，实现每100 g 大豆发根大约能提纯出1 mg 具更高活性与可溶性的蜂毒肽蛋白。而就解决蜂毒肽不良影响这一问题的前沿研究，则已开发出利用仿高密度脂蛋白多肽脂质纳米颗粒作为蜂毒肽的运载体以及新型融合蛋白melittin-mhil-2 等技术，较为成功地克服了蜂毒肽的溶血性和潜在的免疫效应所带来的负面影响。概而论之，蜂毒肽尚需且必要进行进一步研究分析以克服其负面影响，实现更加宽广的实际应用。