云南省鸡滑液囊支原体病原检测及血清学调查

王天葆，李会，李珂，严红亚，覃袖伟，向文彬，陈俊宏，赵蓉*

(1.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南 昆明 650224； 2.广南县旧莫乡畜牧兽医站，云南 广南 663302； 3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

支原体(Mycoplasma)是一类具有独立生活能力的小型原核微生物，广泛存在于自然界，是人和动物常见的病原菌之一。禽支原体感染呈世界性分布，鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)感染被认为是几个国家家禽业的特有病[1]。在我国，支原体病被列为二类传染病，除鸡毒支原体外，多个省市地区都有滑液囊支原体感染的报道。MS可通过直接接触、媒介生物、饲料、饮水等横向感染，又可经鸡胚垂直传播。垂直传播是其主要感染途径，传播率可达100%[2]。

MS是引起鸡和火鸡出现急性或慢性传染性关节炎的一种重要病原,对关节、滑液囊及呼吸道组织有亲嗜性,主要引起鸡、火鸡呼吸道疾病、传染性滑膜炎、关节肿大变形和实质器官肿大，造成鸡只跛行或瘫痪。研究表明，鸡体感染MS后抗体反应缓慢,呈现周期性排毒,水平传播能力强[3]。多数情况下，感染鸡不表现典型临床症状，仅少部分鸡只出现典型临床症状，慢性和无症状感染更常见，可引起鸡群死淘率增高、饲料转化率降低、生长缓慢、胴体降级、蛋品质降低，使肉鸡综合生产的成本增加，给我国养禽业造成了严重的经济损失。

临床上MS感染不是引起家禽死亡的直接原因,但由于其难根除性,且潜伏期较长，造成鸡群持续性感染，在动物体抵抗力降低时加剧其他病原的致病力,增加死亡率。

近年来，随着云南省养禽业的不断发展和雏禽的不断引进，禽病的发生与流行更为错综复杂，MS已经成为云南省养禽业健康发展的重大安全隐患。为全面了解其发生发展情况及流行规律，有效预防控制，对云南省部分规模化养禽场MS的流行情况进行了调查研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品来源

48份疑似MS临床样品来自昆明市、大理州、红河州、普洱市等地区送检的养殖场鸡病变组织及关节液。血清样品368份，用随机抽样法采自昆明市、玉溪市、大理州、曲靖市、西双版纳州、昭通市、普洱市不同规模的养鸡场，翅静脉采集不同品种、不同日龄鸡群的血样。其中肉鸡血清样品124份，采自6个公司8个不同品种，59～110日龄；蛋鸡血清样品244份，采自7个公司7个不同品种，33～480日龄。其中部分处于发病初期或中期，部分处于发病高峰期。

1.1.2主要试剂及仪器

组织基因组DNA提取试剂盒、2×Taq MasterMix、DNA Maker DL1000购自天根生化科技(北京)有限公司，荷兰BioChek公司的鸡滑液囊支原体(MS)抗体检测试剂盒，ELISA洗板机、ELISA读板仪和PCR仪(基因扩增热循环仪)购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，型号为GENESY P6T。电泳仪购自北京六一仪器厂，凝胶成像紫外仪购自Tanon天能公司，型号为Tanon 3500。

1.2 方法

1.2.1临床样品的PCR鉴定

按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书，提取组织和关节液基因组DNA。参照GenBank登陆的MS基因序列，设计引物(上游F:5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；下游R:5′-GTCGTCTCGAAGTTAACAA-3′)，拟扩增片段大小为207 bp[4]。PCR反应体系为25μL，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s,35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。取5μL扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像分析仪观察结果。

1.2.2ELISA血清抗体检测

无菌采集鸡抗凝血，分离血清用于检测抗体。按照荷兰BioChek公司的鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒进行血清样品检测。血清在96孔ELISA板中进行稀释，稀释度为1:500，阴性、阳性对照各设两孔，在包被板上作用一定时间后依次加入各种酶和底物试剂，终止反应后用酶标仪测定405nm波长下的吸光度值(OD405nm)，用S/P值(样品与阳性对照的比值)来表示抗体，S/P值≥0.5，判为阳性。

2 结果与分析

2.1 临床诊断及剖检变化

病鸡两侧跗关节处有黄色干酪样渗出物，明显肿胀突出，瘫痪或跛行，局部温度升高，触之有波动感。剖开流出大量关节液，实质器官肿胀不明显。

2.2 PCR病原检测结果

经过PCR扩增和1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，48份疑似MS临床样品中有10份样品出现与预期符合的207bp条带，经测序后，NCBI Blast比对与已知MS序列相似度达到98%，阳性率为20.83%。部分样品检测结果如图1所示。

M.DNA Maker DL1000；1.阳性对照；2.阴性对照；3～4.检测样品。

2.3 血清学检测结果

2.3.1不同公司鸡滑液囊支原体血清学调查结果

检查来自不同地区的13个公司中皆存在不同水平的MS感染，血清阳性率为4.17%～100%，平均阳性率高达68.48%，结果见表1。

表1 不同公司鸡滑液囊支原体血清学调查结果

2.3.2不同品种鸡滑液囊支原体血清学调查结果

抽检的肉鸡和蛋鸡共15个品种均有不同水平的感染，肉鸡中除品种5由于正处在发病高峰期，血清抗体未检测出外，其余7个品种感染率在43.48%～100.00%，蛋鸡不同品种感染率在46.51%～95.00%，结果见表2。

表2 肉鸡、蛋鸡不同品种鸡滑液囊支原体血清学调查结果

2.3.3蛋鸡和肉鸡不同日龄鸡群鸡滑液囊支原体血清学调查结果

抽检的鸡群中普遍存在MS感染，其中，肉鸡和蛋鸡的血清平均阳性率分别为64.52%和70.49%；不同日龄鸡群之间感染率存在一定差异，除肉鸡呈现感染率随日龄增大而增高的趋势外，蛋鸡感染率分布无明显规律性，各日龄鸡血清阳性检出率详见表3。

表3 肉鸡、蛋鸡不同日龄鸡滑液囊支原体血清学调查结果

3 讨论

3.1 高感染率原因分析

通过对不同鸡场MS血清学的调查，发现MS感染普遍存在，血清平均阳性率达68.48%。根据抽检鸡场的实际情况，发现这些鸡场的环境条件与饲养管理普遍达不到规模化养鸡场的标准，而阳性检出率低的鸡场养殖环境与管理水平相对较好。说明MS感染与饲养管理和环境条件密切相关，提示养殖者应特别注意优化养殖环境，提高饲养管理水平。

通过对不同品种鸡的MS血清学调查，发现鸡群感染无品种间特异性，不同品种的鸡群均可感染MS，表明鸡群感染主要还是与环境和管理等外在因素有关，部分品种阳性检出率相对较低。除上述因素外，是否与种鸡感染程度、鸡种源、不同品种对MS存在一定抗性有关，有待进一步调查[5]。

通过分析蛋鸡和肉鸡不同日龄鸡群感染MS的情况，发现无论是蛋鸡还是肉鸡均有感染，两者的血清平均阳性率均在60%以上，蛋鸡感染比肉鸡感染严重,表明垂直传播还是其主要感染途径；从日龄方面来看，肉鸡感染随年龄的增大而有所增加，蛋鸡感染在年龄上无规律性，可能由于蛋鸡饲养周期较长，存在交叉感染和持续感染等风险。值得注意的是，200日龄以上的蛋鸡鸡群血清阳性检出率均在90%以上，且存在日龄愈大阳性率愈高的趋势。总体结果显示，云南鸡场MS感染存在严重态势，应引起足够重视。

3.2 云南本地防控现状

对云南部分地区13个不同养鸡场MS血清学调查，结果显示云南MS感染阳性率显著高于其他省市的报道，流行情况较为严重，原因可能与采集的样品数量有一定关系，但鸡群中普遍存在MS的感染，应引起重视。由于不同地区流行的MS菌株存在基因型差异，目前，国内MS疫苗使用效果达不到预期，云南省各大鸡场主要依靠投喂药物来预防控制。结合临床实际情况，发现应用药物难以较好地控制MS感染，因此采取综合防治措施是必要的。

3.3 MS综合防控措施

3.3.1构建生物安全体系

回溯调查鸡群场群，发现养殖环境与MS感染密切相关，降低感染风险应从养殖环境入手，改善养殖设施条件，制定切实合理的养殖方案，构建综合的生物安全体系。生物安全体系是投入小、受益大的防疫屏障，应从源头抓起，科学选址，合理布局，净道、污道分离，做好消毒隔离工作，加装通风、控温设施，添置灭蚊蝇灯、挡鼠板、防鸟网等。

3.3.2强化管理，合理用药

制定合理的饲养管理方案，采取全进全出的饲养模式，单一日龄饲养，保持鸡群良好的均匀度，做好季节和天气变化时的通风和控温工作，疫病发生时的隔离消毒和病死鸡处理工作。制定有效的免疫程序和用药方案，定期带鸡消毒。该病治疗效果不明显，但将四环素类、吡酮酸类、支原净或强力霉素等敏感药物混于饲料和饮水中可有效降低MS的感染风险，其中，恩诺沙星被认为有较好的临床效果[6]。用药之前做药敏试验，选择最敏感的药物，并严格遵守休药期，有条件的鸡场应疫苗免疫结合药物治疗加以防治。

3.3.3加强监测，净化种源

培育优质鸡群，首先要做好引种的检疫工作，不从疫点疫区或支原体感染严重的地方引种，从原种开始持续做好疾病净化工作。其次，饲养管理过程中在实行严格的生物安全措施的基础上做到实时监测、定期检查，根据检测结果对阳性鸡进行淘汰、免疫或用药处理。有研究指出，鸡胚传播是MS感染的主要途径，MS理应被加入种禽场检疫对象行列，作为必检项目[7]，为了控制支原体通过鸡胚代代相传，孵育雏鸡之前必须对种蛋进行处理。

综上所述，云南省MS感染现状十分严重，应引起高度重视，防止感染率继续飙升。应建立PCR检测方法，针对病原体的引物和探针设计完整的检测方法，开发和验证一种行之有效的支原体临床诊断技术；广泛开展血清学检测，在监测疾病的同时也可为云南省MS血清流行病学的调查提供数据支撑；综合防制措施不可忽视，生物安全和药物预防是养禽场防控滑液囊支原体和其他疾病必不可少的条件，应严格把关，促进养禽业的可持续发展。