循环游离DNA 在头颈鳞状细胞癌中的研究进展

郑适泽 乔春燕 孟 琳 任飞龙李玮柏 任春霞 陈雨蒙 孙宏晨

（1. 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室； 2. 吉林大学口腔医院病理科；3. 吉林大学口腔医院；4． 吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春 130021）

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）指原发于口腔、咽喉等部位的鳞状上皮细胞恶性肿瘤的总称。 在世界范围内，HNSCC 占所有新诊断癌症的4%，5 年生存率低于50%。 HNSCC 的5 年生存率较低，原因包括早期诊断不明、治疗效果欠佳及缺乏治疗后监测。 近50%的HNSCC 患者在初次诊断时出现淋巴结受累，预后不良[1-2]。 由于其解剖学特性，原发性和复发性HNSCC 的各项检查难度较大。 目前诊断HNSCC所需的临床检查，如影像学检查和组织活检都受到肿瘤位置的阻碍，导致诊断延迟[3]。

近年来， 液体活检成为诊断癌症的辅助手段。它通过生物液体采样，检测多种对癌症诊断和治疗可能具有潜在作用的癌症生物标志物[4-6]。 cfDNA 作为新的肿瘤标记物在癌症诊疗中起重要作用。 与其他生物标志物相比，cfDNA 易于分析， 并且包含特定的与肿瘤和转移有关的改变， 例如单核苷酸突变、甲基化改变和拷贝数变异，因此受到广泛研究。在癌症患者中，含有肿瘤特异性序列改变的cfDNA被称为循环肿瘤DNA(circulating DNA，ctDNA)。 已有研究显示，ctDNA 可能来自原发肿瘤和转移肿瘤的基因组，并反映了肿瘤细胞的克隆性[7-8]。 此前有研究报道了cfDNA 在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌中的临床应用，而cfDNA 与HNSCC 之间关系，国内还鲜有报道。 本文就cfDNA 在HNSCC 中的研究进展做一综述。

1 cfDNA 生物学特征

1.1 cfDNA 的来源

人体可以在多种状态下产生cfDNA，如癌症、运动、衰老、炎症和免疫反应等[9]。 关于cfDNA 的来源，目前有以下观点。 ①坏死： 病理状态下发生细胞坏死，细胞产能和再生能力丧失，细胞和细胞器溶胀，核染色质结块和非特异性消化， 继而通过巨噬细胞对细胞碎片的消化作用，将DNA 片段释放到血液中形成cfDNA[10-11]。 ②细胞凋亡：许多研究表明，细胞凋亡是正常组织和肿瘤产生cfDNA 的主要来源[12]。 其产生的机制可能是脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）将染色体切割成长度为160~180 bp 核小体片段的倍数，并将其释放入血[13]。 ③细胞焦亡：细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是依赖含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase 1）的细胞程序性死亡。细胞发生焦亡时表现为细胞发生肿胀， 细胞膜上形成孔隙，使细胞膜失去完整性，释放内容物，引起炎症反应。 初始时细胞核位于细胞中央， 随着形态学的改变，细胞核固缩，DNA 断裂并释放入血形成cfDNA[14-15]。 ④活细胞的释放： 活细胞释放的cfDNA 是由活细胞新合成的，通过与其他物质复合，包裹在膜结构中或黏附于细胞膜上，可免于核酸酶的降解[16]。 有研究报道，癌症患者血液中的cfDNA 可能来源于“健康”细胞、肿瘤细胞以及肿瘤微环境细胞，同时基质细胞、内皮细胞、淋巴细胞和其他免疫细胞同样成为了肿瘤相关cfDNA 的潜在来源[9,17]。

1.2 cfDNA 的结构

1.2.1核小体 核小体长度约为160~180 bp，凝胶电泳呈特征性梯形结构。 细胞发生凋亡时，半胱天冬酶激活的DNase 和溶酶体DNase Ⅱ降解了染色体DNA，产生了核小体。 核小体由组蛋白八聚体和围绕该蛋白复合物的双链DNA 组成。 围绕组蛋白八聚体螺旋缠绕， 长为147 bp 的DNA 与长为20~90 bp 的接头DNA 相结合确保了核小体的结构完整性，可保护DNA 免受循环系统中酶的降解[11]。

1.2.2微泡 微泡由1 种或几种脂质膜包裹着水室构成，水室中含有细胞成分和分子结构。 微泡的结构包括：外泌体、微粒、凋亡小体，肿瘤状态下这些微泡包含了肿瘤相关DNA。研究人员在癌症患者血液中发现了由癌细胞产生的多种微泡，其含量显著高于健康人[17-18]。 这些微泡具有转化能力，构成了cfDNA 的关键结构[19-20]。

2 cfDNA 的提取与检测

2.1 样品选择

多种生物体液，如血液、淋巴液、尿液、唾液和脑脊液中均含有cfDNA[21]。 样品类型的选择对检测灵敏度有较大影响。检测HNSCC 中的cfDNA 时，样品通常选择血液和唾液。 Wang 等[22]检测了口腔癌患者血浆和唾液中的ctDNA，结果显示将血浆和唾液的分析相结合，灵敏度达96%，高于单独使用唾液或血浆的检测结果。 然而提高检测灵敏度需要满足以下条件： 突变DNA 作为生物标记物具有较高的特异性。 由于预期不出现假阳性，因此可以对多种样品进行检测， 在不影响特异性的情况下提高灵敏度[22]。

2.2 采样方法

有研究人员使用D1000 ScreenTape 系统检测口腔鳞状细胞癌患者血浆中cfDNA 的平均浓度，结果为53.06 ng/mL[23]。 但先前研究报道的结果显示，口咽鳞状细胞癌的cfDNA 浓度为9.60 ng/mL[24]。 这种不相符可能是由于不同研究报道患者的不同、癌症类型的不同，以及血液样本处理、血浆分离和存储方式、DNA 定量方法的不同造成的。 一些因素可能影响cfDNA 的检测，包括样品保存时间、血样的处理、DNA 的定量方法、患者的异质性等。 因此，采血后应立即对样品进行血浆分离， 避免血细胞DNA污染样品。此外，在一个实验室中应采用标准方案集中处理cfDNA 的提取和定量，以限制定量偏差[25-27]。

2.3 检测手段

近年来，已经开发出多种用于cfDNA 检测的技术，可以对cfDNA 从点突变水平到整个基因组水平进行分析。

2.3.1 Sanger测序 Sanger 测序是检测组织DNA突变的金标准。 在液体活检中，Sanger 测序存在2 个问题：①样本中cfDNA 含量较低可能会影响目标基因的测序结果。 ②当样本中肿瘤细胞含量较低时，Sanger 测序的灵敏度不足以检测突变频率低于20%的等位基因[28-29]。由于液体活检中检测的突变等位基因频率范围在0.1%~1.0%， 甚至更低， 使用Sanger 测序可能产生假阴性结果，影响治疗方案的选择[30]。

2.3.2定量PCR目前英国FDA 已批准不能进行组织活检的非小细胞肺癌患者，可以通过定量PCR（quantitative PCR, qPCR）的液体活检来检测cfDNA中基因突变。 有学者使用TaqMan 探针比较qPCR、数字PCR （digital PCR, dPCR） 以及第二代测序（next-generation sequencing，NGS）的突变检测能力，只有qPCR 检测等位基因频率阈值未达到1%，而待测等位基因通常出现频率较低， 目前特异性PCR 可检测的等位基因不足以满足临床需要[31-32]。此外， 商品试剂盒包含了基因的常见热点突变，但并不全面。 并且由于qPCR 检测的致癌突变可能不在所选突变范围内， 使用qPCR 检测可能会遗漏40%~50%的阳性患者[33-34]。

2.3.3数字PCR和微滴式数字PCR为了改善传统qPCR 灵敏度较低的问题， 研究人员尝试了多种特异性等位基因测定法[35]。 数字PCR（digital PCR,dPCR）法用物理方式分离模板等位基因，然后进行单个扩增。 微滴式数字PCR （droplet digital PCR,ddPCR） 在传统PCR 扩增前对样品进行微滴化处理， 经PCR 扩增后对每个微滴信号进行逐一分析。该分析法能绝对定量cfDNA 中野生型和突变型分子，可以检测出频率低至0.01%的等位基因[36-37]。 与qPCR 相比，dPCR 和ddPCR 进行多重分析的能力较差[38]。 与NGS 相比，在测试单个突变时，dPCR 和ddPCR 相对便宜且循环时间短，但是由于其无法检测未知突变，需要先测试突变基因[37]。 由于dPCR 仅需要少量的模板分子，单分子检测对于分析血浆中数量有限的cfDNA 等位基因有较大优势[39]。 dPCR在单分子检测方面具有高敏感性，需要设置恰当的检测标准，仔细处理样本和试剂，防止交叉污染[31]。

2.3.4第二代测序和大规模水平测序 第二代测序（NGS）理论上适用于所有患者，可以从头识别分子变化，包括单核苷酸取代、结构重排和拷贝数变异。尽管NGS 已经成为分析肿瘤组织特征的常规方法，但它对ctDNA 诊断的敏感性仍然不理想[31]。 在一个概念验证性研究中， 使用FDA 批准的Oncomine 靶向测序试剂盒， 检测非小细胞型肺癌患者cfDNA 中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变的敏感性，有效率仅为77%[40]。 为了克服这些问题，研究人员开发了敏感度更高的靶向和全基因组测序。靶向测序通过PCR 扩增和杂交捕获技术富集反复变化的基因座[41-42]。 与扩增子测序不同，基于杂交的方法扩增周期较短，并且可以检测ctDNA 的重排。 与基于扩增的方法相比，NGS 的缺点在于需要较多的cfDNA。 分子条形码可以整合数字误差抑制，将个体化深度测序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）技术敏感性提高到0.000 25%突变等位基因的理论极限值。 因此可以使用分子条形码技术抑制误差，提高扩增子测序方法的灵敏度[41]。

2.3.5全外显子测序和全基因组测序 随着技术的进步，已有研究将全外显子测序（whole exome sequencing，WES） 应 用 于cfDNA 表 征 肿 瘤 分 子[43]。Murtaza 等[7]在研究中用WES 进行疾病监测，并在几个实体肿瘤中检测到与肿瘤进展相关的耐药突变。 尽管WES 可以全面检测分子谱，但它的灵敏度有限。与靶向测序相比，WES 覆盖率低，无法检测到等位基因频率低于5%的稀有突变。因此，基于WES的cfDNA 检测适用于晚期肿瘤及cfDNA 含量增加的患者，但在纵向研究中，低频率等位基因占主要突变时，其检测效果较差。 尽管WES 可以检测“司机突变”，但无法检测“乘客突变”，在精准医疗的应用中，它可以提供的信息十分有限[44]。

3 cfDNA 的临床应用

目前，ctDNA 在HNSCC 中的应用主要集中在以下2 个方面： ①作为评估肿瘤负荷的生物标志物；②检测肿瘤基因异质性。 ctDNA 液体活检作为一种无创检查，有着重要研究价值，适用于高风险或治疗前诊断不明确的患者， 例如治疗方案存在争议的癌前病变，严重的增生性病变，活检可能遗漏的、潜在的恶性病变。 此外，某些HNSCC 患者局部转移灶较小，无法通过组织活检进行采样和检测。 在治疗后阶段， 具有较高敏感性的ctDNA 可以作为生物标志物，评估HNSCC 病变残留或局部复发情况。

3.1 cfDNA 用于HNSCC 的诊断

cfDNA 检测具有微创性,这一方法可能成为辅助组织活检的新手段。 大量研究表明,cfDNA 水平的增高可能提示肿瘤的发生[45]。 Mazurek 等[24]通过qPCR分析了200 例HNSCC 患者的cfDNA 水平， 检测人乳头瘤病毒16 型 （human papillomavirus，HPV16）、HPV18，鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS）和EGFR突变。 与对照组相比，HNSCC 患者的平均总DNA 水平较高， 但差异无统计学意义。 与其他HNSCC 患者相比，口咽鳞状细胞癌患者的总cfDNA 含量更高。 研究人员还证明了ctDNA 浓度与淋巴结转移、 分期和年龄之间存在显著相关性，有14%的患者呈HPV 阳性，其中大多数为HPV16 阳性（96.4%），而未检测到EGFR和KRAS突变。 然而这些结果表明， cfDNA 检测可用于HPV阳性HNSCC 的诊断[22]。

3.2 cfDNA 用于HNSCC 治疗后监测

Wang 等[22]利用安全测序系统（safe-sequencing system，Safe-SeqS） 检测HNSCC 患者血浆和唾液样本中ctDNA， 灵敏度达到96%。 研究人员对9 例HNSCC 患者血浆和唾液样本进行研究，在复发4 例患者中的3 例患者术后4~8 个月的样本中检测到了ctDNA，早于临床证据19 个月，而在没有复发患者中，未检测到ctDNA[22]。 Chuang 等[46]收集了59 例HNSCC 患者的唾液冲洗液，cfDNA 呈HPV 阳性的20 例中有4 例复发， 其中2 例治疗后唾液冲洗液中的cfDNA 呈HPV 阳性（敏感性=50%）；而在39 例HPV16 阴性患者和16 例未复发的HPV16 阳性患者中，治疗后唾液冲洗液中的cfDNA 均不显示HPV16 阳性（特异性=100%）。 Rave 等[47]通过实时定量PCR 检测了70 例患者的cfDNA，TNM 分期为Ⅲ期或Ⅳ期的HNSCC 患者中，6 例血清DNA 呈HPV阳性的患者中有4 例发生了远处转移。

Sun 等[48]报道，唾液冲洗液中具有组织金属蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitors of metalloproteinase 3, TIMP3）启动子超甲基化HNSCC 患者患者的局部复发生存率比无甲基化HNSCC 患者低。 在另一个队列中，研究人员在患者治愈后6 个月时收集了唾液冲洗液样本，其中检测到TIMP3 甲基化患者的局部复发生存率较低[49]。 Schrock 等[50]检测了HNSCC患者cfDNA 中矮小同源盒基因 （short stature homobox 2,SHOX2）、SEPT9基因甲基化水平， 证明cfDNA 甲基化水平与淋巴结受累和死亡风险相关，并且最早在临床出现复发或转移前377 d 时， 可以检测到患者cfDNA 甲基化水平升高。 这些研究证明了在液体活检中， cfDNA 甲基化检测可以用于治疗后监测[49]。

在另一项研究中，研究人员通过使用微卫星标记分析等位基因失衡，在超过50%的样本中检测到血清中ctDNA 等位基因失衡， 而血清DNA 的等位基因失衡与肿瘤分期之间存在相关性[51]。 以上研究都证明cfDNA 作为预测HNSCC 复发、 远处转移的生物标志物，具有潜在研究价值。

3.3 cfDNA 用于HNSCC 耐药性检测

识别肿瘤驱动突变和表观遗传修饰能力有助于实现靶向治疗，改善患者预后[52]。 HNSCC 具有较大的肿瘤遗传异质性， 即肿瘤不同部位可能存在不同突变，导致不同肿瘤细胞的耐药性不同。 组织活检通常只检测肿瘤的几个部位， 检测结果可能存在偏倚。 而cfDNA 是从全身肿瘤细胞中脱落的，可以检测到多种耐药基因[53]。有研究将肿瘤活检与cfDNA 检测相比较，在单次组织活检未发现耐药性改变的患者中，利用cfDNA 检测到2/3 患者的耐药性改变[54]。cfDNA 中分子变异的检测已经成为检测临床耐药性的重要手段， 是实现精准医疗的重要一步。

4 cfDNA 在肿瘤中的作用

4.1 介导细胞间基因转移

1965 年，Bendich 等[55]发现注入小鼠体内的肿瘤DNA 是肿瘤发生、发展的起源，他提出了基因组转移的观点并得到广泛验证。 基因组转移假说：肿瘤细胞释放的cfDNA 可以在距原发肿瘤一定距离的地方转染健康细胞，导致肿瘤转移[56]。 Anker 等[57]最先证明了SW480 肿瘤细胞培养基中的cfDNA 对NIH/3T3 小鼠成纤维细胞具有转染和转化能力。 在加入SW480 培养基后，NIH/3T3 细胞不仅变得具有肿瘤性， 而且还携带SW480 细胞系中的KRAS突变。2010 年，Garcia 等[58]在携带KRAS突变的大肠癌患者中观察到相同的现象。含有cfDNA 的多种结构都可能与基因组转移有关，已经有研究证明凋亡小体、微粒体、外泌体都可以在肿瘤原发灶远处形成这种变化[19-20]。

4.2 肿瘤细胞识别cfDNA 机制

有研究报道，cfDNA 是Toll 样受体（toll-like receptors, TLR） 的分子配体，TLR 存在于树突细胞和巨噬细胞中，与先天免疫反应有关。 配体-TLR 相结合激活转录因子NFkB/AP1， 该因子可以调节炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-1（interleukin-1 IL-1）、白细胞介素-6 （IL-6）， 以及共刺激分子CD80、CD86 表达。 在特殊的病理状态下，cfDNA 可以免于被核酸酶降解，并且可与其他蛋白质复合，移动到与核酸识别相关的细胞TLR 中， 如TLR3、TLR7、TLR8、TLR9[59]。 有研究表明，口腔癌细胞可以表达TLR3、TLR7、TLR9，相应配体刺激其产生，并且可以通过调节趋化因子、炎症因子、促血管生成因子的表达，影响肿瘤免疫微环境，对肿瘤发生、发展起作用[60]。然而HNSCC 产生的cfDNA 将如何影响TLR 表达，尚无这方面报道。

4.3 cfDNA 与肿瘤免疫

cfDNA 是具有免疫刺激特性的生物大分子。 独有的双链DNA 分子结构、 特定的序列以及分子间相互作用使其具有刺激免疫反应发生的能力。 暴露于固有免疫系统的cfDNA 可以激活干扰素（interferon，IFN）以及其他促炎因子基因[9]。 有研究发现，cfDNA 可以通过细胞质DNA 感应机制[如环GMPAMP 合 酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）]介 导TLR9 独立的免疫应答， 激活干扰素基因的刺激物（stimulator of interferon gene, STING）导致γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）分泌增加。另有研究表明IFN-γ可以增强树突细胞对口腔鳞状细胞癌的抗肿瘤免疫应答[61-62]。Waldvogel 等[63]用健康人血液提取的循环游离核酸与单核细胞共培养， 观察到其固有免疫相关基因表达上调。 趋化因子可以通过调控肿瘤免疫微环境直接促进癌细胞迁移， 也可以间接促进癌细胞转移扩散，促进癌症的发生、发展[64]。而HNSCC 产生的cfDNA 如何调控细胞因子表达进而调节肿瘤免疫，还有待研究。

综上所述， 基于cfDNA 的液体活检是一种无创、有经济效益并且具有肿瘤特异性的检查，多项研究表明cfDNA 可用于HNSCC 诊断、 治疗后监测及耐药性检测。 然而，目前cfDNA 检测仍然存在敏感度不够高、缺乏标准化程序等问题。 此外，尽管我们已经知道产生cfDNA 的机制可能包括细胞坏死、细胞凋亡、细胞焦亡、活细胞释放，但对于它的来源、生物学特征及生物学作用，还有待研究。 未来仍需更多的临床试验和基础研究为cfDNA 用于临床诊断、个性化精准治疗、药物开发提供必要的理论基础。