微小RNA对骨衰老调控的相关研究进展

赵 萌，江莉婷，高益鸣

骨组织在结构上主要由外层的皮质骨和内部的松质骨构成，皮质骨厚而致密，抗压和抗扭曲能力强，松质骨疏松多孔，具有较高的代谢和重塑率；组织学上由骨基质和骨相关细胞构成，骨相关细胞包含成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和骨细胞[1]。BMSCs具有成骨分化、成软骨分化和成脂分化等潜能，是骨相关细胞的重要来源。成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡维持了骨组织的稳态[2]。随着年龄的增长，骨吸收速度逐渐超过骨形成速度，在组织学水平表现为骨密度、骨体积分数和骨小梁数量明显下降；皮质骨变薄，松质骨细胞含量减少[3]。在细胞学水平主要表现为BMSCs增殖能力、成骨分化潜能下降以及成脂分化增加，临床表现为年龄相关的骨质疏松[4]。

微小RNA(microRNA, miRNA)作为重要的转录后调控因子，调节基因的表达和转录。目前发现多种miRNA调控BMSCs成骨分化，参与骨组织的老化过程[5]，BMSCs分化方向、细胞成骨能力、成骨相关细胞因子含量和有关的miRNA水平都有联系。miRNA对年龄相关骨组织的调控为骨老化引起的骨吸收、骨密度降低和年龄相关的骨质疏松的临床治疗提供了新的思路和理论依据，本文就miRNA对骨组织衰老的调控和研究进展作一综述。

1 miRNA的生物学特性

miRNA是长度为19～21个核苷酸(nt)的非编码小分子RNA，高度保守，与mRNA的3′非编码区(3′untranslated region, 3′-UTR)互补结合，降解mRNA或者抑制其翻译，从而调控基因的表达和转录[6]，参与细胞的增殖、分化和衰老。miRNA首先通过RNA聚合酶Ⅱ在细胞核内合成具有发夹结构的pri-miRNA，在细胞核中核糖核酸酶Drosha处理下形成60～70 nt长度的pre-miRNA分子；pre-miRNA通过Ran-GTP相关的ExPortin-5蛋白转运进入胞浆中；pre-miRNA在胞浆内被Ⅲ型核糖核酸内切酶Dicer进一步裂解，产生20 nt左右的miRNA，与RNA相关蛋白结合，形成基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，作用于目的基因mRNA的3’-UTR，互补结合，调控基因表达[2,7]。miRNA作为重要的转录后调节因子，调控机体半数以上的蛋白质表达；同一miRNA可调控多个靶基因，同一靶基因也可受到不同miRNA的作用，形成复杂的转录后调控网络[2]。

2 miRNA在骨衰老中的作用

研究表明，有一些特殊的miRNAs通过3′-UTR和目的基因mRNA互补结合，在骨质疏松、衰老、骨折等过程中发挥了重要的作用。无论是正常生理过程还是病理状态，这些miRNA表达异常都可能引起基因表达改变，从而影响细胞水平甚至骨组织表型的改变。Ruben等研究发现，与年轻组相比，老年小鼠及人类骨组织中miR-219a-5p表达降低，并通过调控靶基因维甲酸受体相关孤儿受体β(retinoic acid receptor-related orphan receptor beta, Rorβ)的表达参与衰老过程中骨稳态的调节[8]。Liu等[9]在老年小鼠血清中发现衰老相关标志物p53显著增高，体外实验发现在年轻BMSCs中过表达p53，p53表达的增加通过抑制miR-17-92簇并靶向调节Smurf1基因来抑制BMSCs的成骨分化。Lee等[10]在老年人间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)以及老年小鼠骨髓来源的MSCs中发现AIMP3/p18表达显著上调，并首次证实miR-543以及miR-590-3p通过直接与AIMP3/p18转录因子结合，下调AIMP3/p18表达，从而调节MSCs衰老。此外，研究发现还有一部分miRNA的含量在老年骨组织中增加，并且和成骨分化相关的标志物负相关，这部分miRNA通过作用于靶基因，减少骨形成，促进骨吸收。Liu等[11]发现老年骨质疏松患者血清miR-96显著上调，在老年人和小鼠的BMSCs中同样也发现了miR-96表达的上调，进一步研究发现在年轻小鼠体内过表达miR-96后，骨小梁厚度和数目都明显降低，抑制了骨形成，相反，在老年小鼠体内抑制miR-96表达后，骨密度升高、骨强度增加。Xu等[12]发现miR-31a-5p也随着年龄的表达明显增加，与年轻大鼠相比，来自老年大鼠BMSCs的外泌体中miR-31a-5p水平显著升高，并通过影响成骨细胞、促进破骨细胞分化引起骨吸收，在骨髓微环境下，抑制miR-31a-5p表达可以有效地减少骨丢失，减少老年大鼠的破骨活性，从而可能成为绝经后骨质疏松潜在的治疗靶点。Davis等[13]研究结果表明，衰老和氧化应激可以显著改变骨髓微环境中细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的miRNA转运，尤其是miR-183-5p在老年EVs中高表达，并推测可能通过降低血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1, Hmox1)活性在干细胞衰老和成骨分化中发挥作用。

BMSCs作为骨组织的干细胞具有多向分化潜能，分化方向受到多种因素的调节。BMSCs衰老和成骨潜能受损与绝经后骨质疏松密切相关。衰老BMSCs形态多样化，核质比降低，增殖能力、成骨、成软骨的能力下降，p53、p21含量增加，并且抗衰老酶沉默信息调控子1(silent information regulator1, SIRT1)的含量也明显降低[14]。随着骨组织老化的进行，骨髓中脂肪组织堆积，间充质干细胞处于细胞间期的数目增多，miRNAs参与了这些过程并发挥着重要的作用。Kranjc等发现miRNA的过表达，和BMSCs的干性失调相关，比如hsa-mir-371、hsa-mir-369-5p、hsa-mir-29c、hsa-mir-49和hsa-let-7f的上调；还有miRNA290-295簇，miRNA302-367簇通过对细胞周期的调节，在小鼠的胚胎干细胞干性维持中也有很重要的作用[4]。Fan等[15]发现miR-1292过表达加速人脂肪来源间充质干细胞(human adipose derived stem cells, hADSCs)衰老并抑制骨形成，相反，miR-1292上调抑制体内异位骨形成，进一步研究发现miR-1292通过Wnt/β-catenin信号通路来调节hADSCs衰老和成骨。此外，模式动物研究表明靶向过表达成骨细胞系内的miR-188水平后，小鼠出现了更显著的增龄性骨丢失以及骨髓内脂肪组织堆积[16]；Li等[17]发现miR-10b通过SMAD2抑制hADSCs体外脂肪分化，并部分通过TGF-β途径平衡hADSCs的成骨和成脂分化。

3 与骨衰老相关的miRNA

骨组织衰老过程中的蛋白表达变化受到miRNA的调控，既往研究报道衰老骨组织中表达增加的miRNA有：miR-199、miR-34、miR-214、miR-384等，在衰老骨组织中表达明显降低的miRNA有：miR-219a-5p、miR-17、miR-130a等。

3.1 miR-34s

miR-34家族成员有miR-34a、miR-34b以及miR-34c[18]。近期研究表明，包括外泌体和微囊泡在内的EVs，在细胞群之间运输miRNA、脂质以及蛋白，参与了许多重要的生理、病理过程。Fulzele等认为衰老的细胞可能分泌一些因子来影响邻近细胞和组织，他们在老年小鼠骨骼肌以及血清EVs中检测到miR-34a-5p表达显著增高，体外实验进一步证实，来源于老龄小鼠肌肉EVs携带的miR-34a-5p直接加速了BMSCs的衰老[19]。相对于miR-34a，miR-34b和miR-34c是成骨过程中重要的调节因子，Wei等[18]构建成骨细胞特异性miR-34s缺陷的模式小鼠，首次通过体内实验证实miRNA家族可以调节成骨细胞增殖或分化，研究发现成骨细胞内miR-34c特异性过表达后显著降低了机体的骨量，机制研究发现miR-34b/c通过下调细胞周期蛋白D1(Cyclin D1),细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinases, CDK4)及CDK6抑制成骨细胞增殖，同时通过下调SATB2来抑制成骨细胞的终末分化；同样，Tamura等[20]发现抑制miR-34表达后成骨细胞的骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)表达增加。Bae发现miR-34c过表达的小鼠，随着年龄增加，长骨的骨量、骨小梁的厚度和数量都显著下降，miR-34c表达的增加降低了成骨细胞数目和增殖能力；体外实验发现miR-34c抑制BMSCs向成骨细胞分化的同时促进破骨细胞生成[21]。

3.2 miR-199

研究表明，miR-199a在骨骼系统中特异性表达。Ukai等[22]通过检测不同年龄人膝关节软骨发现miR-199a-3p参与了软骨细胞的衰老，miR-199a-3p在软骨细胞中的含量随着年龄的增加逐渐增多，并可以抑制软骨相关的SOX9、Ⅱ型胶原的表达。Lin等[23]发现miR-199a是BMP2早期响应的靶点，它通过直接靶向调控转录因子SMAD1来负性调节早期软骨细胞分化。类似地，Laine等[24]亦发现抑制miR-199a后会引起SOX9表达升高，提示miR-199a在BMSCs成软骨过程中的负性调节作用。

miR-199a-3p与miR-199a-5p都是miR-199a前体的两种成熟形式，与miR-199a-3p不同，早期研究发现miR-199a-5p可能靶向作用于LIF基因，从而维持MSCs干性，近期研究发现miR-199a-5p可能通过抑制干性相关基因来启动MSCs分化，并通过调控HIF1a-Twist1信号通路来促进成骨细胞成熟[25]。此外，Shuai等[26]报道miR-199a-3p在MSCs成脂分化中起了关键的作用，他们发现在骨髓来源的MSCs成脂分化过程中miR-199a-3p表达逐渐增加，抑制该miRNA发现脂肪分化减少，转染miR-199a-3p后BMSCs成脂相关的过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)基因表达升高，油红O染色阳性率增加,机制研究发现miR-199a-3p通过靶向KDM6A经WNT信号通路调节BMSCs的成脂分化。

3.3 miR-214

miR-214在老年骨组织中表达升高，与骨形成负相关。Wang等[27]在老年患者骨折样本中检测到miR-214表达显著升高，进一步的机制研究发现抑制卵巢切除小鼠成骨细胞中miR-214表达后，松质骨骨量以及骨微结构显著增强，并且miR-214通过直接调控其靶基因转录激活因子4(activating transcription factor 4, Atf4)发挥效应。骨骼是一种动态平衡的组织，由成骨细胞介导的骨形成以及破骨细胞介导的骨吸收协调调控，过多的骨吸收及骨形成减少会导致骨量降低，从而引起老年性骨质疏松和骨折。随着研究的深入，越来越多的证据表明破骨细胞可以通过直接的细胞接触及有效的“旁分泌”途径实现破骨细胞与成骨细胞之间的通信。近期的一项研究结果首次发现在骨折的老年女性以及卵巢切除的老年小鼠破骨细胞以及血清外泌体中miR-214-3p显著增高，推测与骨形成减少相关，进一步研究证实，血清中的miR-214-3p特异性来源于破骨细胞，破骨细胞分泌的外泌体可以输送miR-214-3p作用于成骨细胞，抑制成骨细胞活性，从而抑制骨形成，反之抑制破骨细胞的miR-214-3p可促进骨形成[28]。同样，Li等[29]也报道在BMSCs成骨分化过程中，miR-214表达下调，当miR-214表达上调时，通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性来抑制BMSCs的成骨分化。

3.4 miR-384

有学者发现miR-384-5p在老龄大鼠BMSCs的含量显著高于年轻大鼠，年轻BMSCs中过表达miR-384-5p抑制成骨并且促进细胞的衰老，相反地在老年BMSCs中抑制miR-384-5p则可增加矿物沉积而且SA-β-gal染色阳性率下降；Li等[30]研究证实老年大鼠骨髓腔中注射miR-384-5p抑制剂3个月后，CT扫描发现骨小梁数目和体积都明显高于对照组。衰老骨组织中表达增加的miR-384-5p在骨质疏松过程中调控骨质的形成和吸收。Zhang等发现miR-384-5p和miR-212在骨质疏松动物模型血清中的表达也显著上调，小鼠骨髓MSCs成骨诱导时表达下降，相应的miRNA拮抗剂可促进成骨，减轻骨质疏松的症状, 进一步研究发现，miRNA拮抗剂通过RNUX2/OPG/RANKL通路促进成骨分化[31]。

3.5 其他相关的miRNA

除了以上miRNA参与了骨组织衰老变化的调节外，还有很多相关的miRNA也参与了骨组织的老化过程。Li等[16]发现miR-188和年龄依耐性的骨流失相关，老年小鼠骨髓腔中脂肪堆积增多，成骨细胞数减少，miR-188的含量是年轻小鼠的30倍；miR-188促进BMSCs的成脂分化，在BMSCs诱导成脂时PPARγ mRNA的含量协同miR-188增加，而且在老年小鼠骨髓腔中注射miR-188拮抗剂，减少了脂肪细胞，增加了骨小梁的量和骨内膜内成骨细胞的数目。Ruben等发现miR-219-5p在老年小鼠和老年人骨样本中表达较年轻样本明显降低，同时伴随着衰老相关的Rorβ的升高；双荧光素实验证实Rorβ为miR-219a-5p的靶基因，转染miR-219a-5p后Rorβ mRNA降低了约60%，成骨相关的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)mRNA增多[8]。Lin等[32]也发现BMSCs随着年龄的增加，成骨能力下降，脂肪分化能力上升，miR-130a在老年BMSCs的含量显著低于年轻人组；miR-130a在BMSCs成骨分化时表达增加，过表达miR-130a可增加Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, RUNX2)、Osterix的表达，持续促进miR-130a表达3个月后发现皮质骨厚度增加，脂肪细胞数量减少；还证实了miR-130a通过负向调控Smurf2促进BMSCs成骨分化，同时还以PPARγ为靶基因抑制BMSCs的成脂分化。

4 miRNA参与调控间充质干细胞成骨分化相关信号通路

BMSCs具有脂肪、软骨、成骨细胞分化潜能，miRNA的差异表达参与BMSCs的差异分化[33]，miRNA通过BMP、Wnt/β-catenin、TNF-α、Notch等信号通路对BMSCs的增殖和成骨分化进行调控[34]。

4.1 BMP2信号通路

BMP3是BMP家族中骨形成和分化的负向调控因子；Fan等发现BMP3是miR-450b的直接靶点，过表达miR-450b可促进hADSCs异位成骨[35]。miR-153在BMSCs成骨分化时降低，荧光素酶实验发现miR-153和骨形态发生蛋白受体Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ, BMPRⅡ)部分结合负性调节BMSCs成骨，过表达miR-153后，ALP、I型胶原和OCN较对照组降低[36]。Hwang等[37]发现miR-140-5p在人类MSCs中富集，该miRNA直接抑制MSCs中BMP2的表达，阻断miR-140-5p后发现BMPR2、BMPR1B和SMAD6的表达增加。

4.2 Wnt/β-catenin信号通路

Zhang等[38]发现小鼠胚胎细胞和肥大细胞中miR-335-5p高表达，靶向抑制Wnt信号通路拮抗剂Dickkopf-1(DKK1)促进成骨分化能力，通过构建转基因小鼠模型，发现miR-335-5p靶向下调DKK1蛋白在骨组织中的表达，成骨相关的标记蛋白水平高于不同年龄的对照组；BMSCs诱导成骨时，转基因小鼠中SOX9表达降低。多种衰老的内皮细胞中均高表达miR-31，衰老细胞分泌的EVs和ADSCs共培养，降低ADSCs的骨分化、钙沉积；Weilner等发现衰老细胞来源的EVs使ADSCs的miR-31升高3倍，并伴随卷曲蛋白3(Frizzled3, FZD3)mRNA水平的降低，抗miR-31转染可有效逆转EVs介导的ADSCs成骨抑制和FDZ3的下降[39]。Fan等[15]发现miR-1229在hADSCs的表达和年龄相关，过表达miR-1292显著抑制FZD4 mRNA 3′-UTR载体的荧光素酶活性，途径分析显示miR-1292通过Wnt/β-catenin信号通路调控hADSCs的成骨和衰老。

4.3 NF-κB信号通路

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)诱导miR-150-3p的表达增加从而抑制BMSCs中β-连环蛋白，抗miR-150-3p可阻断TNF-α对β-连环蛋白的抑制；进一步研究发现TNF-α通过升高p65磷酸化水平激活IKK/NF-κB信号通路增加miR-150-3p的表达，抑制BMSCs的成骨分化[40]。TNF-α作为重要的成骨分化抑制因子，在体内外微环境中影响着间充质细胞的成骨过程。Deng等发现TNF-α抑制BMSCs成骨分化，并诱导miR-23b高表达，NF-κB抑制剂可消除TNF-α对BMSCs成骨的抑制作用；在小鼠尾静脉连续注射miR-23b激动剂可导致骨密度降低、骨小梁数目减少以及骨髓腔增大；但是Trap染色显示和对照组无明显区别，提示miR-23b主要是通过抑制成骨而非促进吸收来减少骨形成[41]。

4.4 Notch信号通路

Notch作为成骨分化的负向调控因子，对MSCs的干性维持十分重要，是维持骨稳态的必要因子。幼年小鼠敲除Notch后促进成骨细胞的分化，早期骨量明显增加、髓腔变窄；但是严重减少了青春期骨髓间充质祖细胞的数量，导致敲除Notch的实验小鼠随着年龄的增长骨量迅速丧失[42]。细胞和动物实验中发现miR-487b-3p的表达均和Ⅰ型胶原、OCN、RUNX2、BMP2负相关，miR-487b-3p转染细胞后Notch调节的锚蛋白重复序列蛋白(Notch-regulated ankyrin-repeat protein, Nrarp)mRNA表达下降；调节机制研究发现miR-487b-3p通过靶向Nrarp抑制Wnt信号通路激活并上调Notch信号通路抑制成骨细胞功能[43]。

4.5 其他相关信号通路

除了以上常见的信号通路对骨组织的调节外，miRNA还通过多种信号通路参与间充质细胞的成骨分化；例如：Smurf介导RUNX2泛素化减少成骨;老年小鼠BMSCs中的衰老相关基因Smurf1明显升高，miR-17通过p53/miR-17/Smurf1信号通路抑制靶基因Smurf1表达，促进老化BMSCs的成骨分化[9]。还有部分miRNA并非通过单一的信号通路进行调控，而是多条信号通路的相互调节[40]。

综上所述，miRNA作为高度保守的非编码小分子RNA，通过与mRNA的3′-UTR互补结合，降解mRNA或者抑制其翻译，从而调控基因的表达和转录，参与细胞的增殖、分化和衰老。在骨组织衰老过程中，miRNA可以通过直接或者间接作用于成骨相关因子，调控BMSCs的成骨分化过程；另一方面，老年骨组织中降低的miRNA可能和骨组织的再生和重塑密切相关，miRNA的过表达，有利于促进衰老的BMSCs增殖和成骨。鉴于miRNA在骨老化中的重要作用，结合临床中老年患者缺牙的高发病率及其颌骨吸收的普遍现象，笔者认为骨老化相关的miRNA表达差异和调节的研究，特别是老年人群牙槽骨组织吸收和miRNA的联系，可以为老年人群失牙修复和功能重建提供新的理论依据和方法。