软骨再生的研究进展

杜艳平，孙永琨

(新乡医学院，河南 新乡 453003)

由于软骨没有神经组织和血管，一旦软骨组织受到损伤，缺损面积较小时依靠机体自身修复可以填充空隙，但不可能完全恢复软骨的正常结构。而当缺损大于3 mm时，即无法自行修复。因此，再生受损的软骨备受关注，具有很大的技术发展潜力。对于软骨再生的研究主要集中在三个方面[1-4]：(1)诱导软骨的自然愈合过程，如微骨折术；(2)移植能生成软骨的细胞或组织，比如骨膜、软骨膜 、骨软骨或软骨细胞等。(3)软骨组织工程技术。

1 微骨折术

微骨折术是一种新型的微创手术，借助关节镜直视作用，对软骨缺损位置进行定位，采用刨刀清除关节中已经钙化的软骨。观察无问题后，采用微骨折尖椎，在骨板上进行钻孔，骨髓和血液从孔中渗出，形成血液凝块，里面含有的干细胞可以分化成纤维组织、纤维软骨或者类透明软骨构成的替代性组织，修复原有受损的软骨[5]。理查德·斯蒂德曼博士(Richard Steadman)在20世纪80年代和90年代初完善了这一手术，并且通过在马上进行的实验研究，逐渐改进了治疗方法。后来专业运动员开始注意到这种技术，专业运动员约翰·斯托克顿和安芬尼·哈达威均在手术取得成功后两个月重返赛场，但两人手术效果却完全不同。斯托克顿打球到退役，而安芬尼很快又受伤了，并接受了第二次手术。目前的统计数据显示，45岁或45岁以下的患者有75%至80%的成功率。

微骨折术操作简单、损伤较少，治疗小面积软骨缺损的效果优于大面积软骨缺损，软骨缺损的面积为2-4 cm2使用微骨折治疗的效果不好[6]。微骨折软骨修复为纤维软骨修复，手术后生成的血液凝块非常脆弱，修复后18个月内即可见软骨退变[7]。尽管软骨存在退变现象，但是微骨折术后2年的时候临床评分在仍然保持在较高水平[8]。

关节镜下微骨折术在改善膝关节软骨缺损，保证患者的整体治疗效果中起着关键作用[9]。这项技术随着科技进步也在不断改良，如Stanish等[10]将壳聚糖与自体全血混合填充到微骨折治疗的软骨损伤中，结果发现这种方法有利于增加血块的稳定性，促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化。另外Sharma等[11]成功应用可注射性水凝胶结合微骨折修复不规则软骨损伤。

研究报告称骨髓刺激术在年轻患者中，特别是小范围损伤的治疗效果显著，而对于年龄偏大者效果欠佳。以微骨折术的形式修复治疗软骨缺损的类型不是透明软骨修复，而是纤维软骨修复，极早就会发生退化，所以目前诸多研究致力于发展改良微骨折术。

2 移植能生成软骨的细胞或组织

2.1 自体骨膜移植

骨膜位于骨表面， 外层为纤维层，内层是生发层。 其中生发层含有很多的细胞成分，它始终保持分化增殖的能力。1982年，Rubak实验证明骨膜具有向软骨转化的能力，后来得到了更多的学者的实验证实。另外滑膜液为软骨增生提供营养，将游离的骨膜放入滑膜液中，骨膜完全形成软骨。

自体游离骨膜移植所取的骨膜以胫骨前方最佳。切取自体骨膜时采用锐性游离， 动作轻柔，防止损伤骨膜内层的生发层细胞。移植的骨膜应与软骨缺损区的骨面紧密固定缝合。固定骨膜时牵拉程度要适中，若过大会使单位面积上的细胞数量减少，会引起骨膜的撕脱和移位。反之，牵拉程度过小会使骨膜重叠，造成修复组织的不完整[12]。

杨贵勇等[13]在研究中发现骨膜比滑膜和软骨组织对相关基因表达作用更明显，是因为骨膜本身含有未分化的间充质前体细胞较多，有分化生长的潜能。李稔生[14]认为自体骨膜移植修复关节软骨缺损的近期临床效果良好，但远期效果不佳。Madsen 等[15]报道了18例膝关节剥脱性骨软骨炎患者自体骨膜移植后疼痛缓解者仅2例，其中 8 例(44%)术后8年中分别由于活动受限、滑膜炎或骨赘形成而再次手术，认为该方法缓解疼痛的比例小，再手术发生率高。

自体骨膜移植取材有限，骨膜形成软骨面的能力受多种因素影响，比如年龄、供体的位置、移植的方向等，所以预期治疗效果很难确定。

2.2 自体骨软骨移植

1997年，Hangody首先报道了152例病例，是利用膝关节的非负重区的柱状软骨块植入全层软骨缺损区治疗膝关节全层软骨缺损，最后获得透明软骨，且愈合速度也相对较快，取得了满意的临床效果。

Marcacci 等[16]对30例软骨损伤面积小于 2.5 cm2的患者进行自体骨软骨移植。7年的随访结果表明，对于较小的软骨损伤，中长期效果良好。Lane 等[17]发现面积小于2 cm2的软骨损伤的修复效果最好，对面积为2～4 cm2的软骨损伤也有较好的临床效果。由于但受供区材料来源的限制，这种方法通常只用于损伤面积较小的患者。另外同种异体软骨移植来源虽然广泛，但由于移植排斥反应及疾病传播的风险，一定程度上受到限制[18]。

2.3 自体软骨细胞移植

自体软骨细胞移植是将自体软骨细胞进行体外扩增后移植到全层软骨缺损区域的技术[19]。自体软骨细胞移植术首次实施成功是由1987年瑞典医学家Peterson等[20]以兔子为模型上完成。1994年瑞典的Brittberg等[21]首次将这一方法运用于临床治疗中。2003年Pavesi等[22]用三维支架负载自体软骨细胞，修复人关节软骨缺损获得较好效果。关节镜检96.7%修复基本满意，主要缺损区修复为透明样软骨组织。自体软骨细胞移植技术的出现，帮助很多软骨损伤的患者看到了希望。随着研究的发展，这项技术也在不断创新。

第一代自体软骨细胞移植技是在关节镜下取关节软骨，分离出软骨细胞体外培养扩增后，将细胞悬液注射至缺损处，最后覆盖自体骨膜缝合，这种方法可以修复软骨损伤的深度超过 6-8 mm[23]，但是也有许多缺点，如细胞悬浊液的外漏，骨膜的增生等，需要关节镜进行手术切除[24]。

第二代自体软骨细胞移植技术是用一些生物膜如胶原膜等与周围组织缝合，而不是用骨膜。研究表明，两代的临床疗效相似，第二代的并发症少于第一代[25]。虽然费用比用自体骨膜高，但无需进行二次手术，因此更为经济[26]。

第三代基质诱导的自体软骨细胞移植是将体外培养的软骨细胞扩增，植入Ⅰ/Ⅲ双层胶原膜的粗糙表面，然后再植，最后使用更具生物相容性的纤维蛋白胶进行粘接，消除了缝合的需要，使手术更容易，而且降低了细胞渗漏的风险[27]。

3 软骨组织工程技术

20世纪90年代，多学科的发展使软骨组织工程技术应运而生。构建组织工程软骨需要满足三个条件：(1)足够的正常功能的种子细胞；(2)合适的细胞支架；(3)调节细胞增殖的细胞因子[28-29]。

3.1 种子细胞

种子细胞应满足以下要求：可以通过无创或微创方法获得；分裂和增殖能力强；无免疫排斥；可连续传代；传代后形态、功能和遗传物质不发生变化。

首先自体软骨细胞取自患者本身，没有免疫排斥，细胞的相容性好，没有伦理学障碍。然而，自体软骨细胞是有限的，并且取材部位会有不同程度的损伤。此外，在体外传代培养后很容易转化为成纤维细胞。

同种异体种子细胞应用较多的是具有多向分化能力的干细胞，在特定的诱导条件下，可以转化为软骨。其中骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞均为重要的种子细胞[30-31]。有学者将骨髓间充质干细胞植入软骨缺损中，移植时未使用任何载体，发现新生组织为透明软骨。由于其免疫原性低，细胞生命周期长，细胞分裂能力强，因此受到越来越多的关注。另有学者在修复关节软骨缺损时使用骨髓间充质干细胞结合I型胶原，结果植入的骨髓间充质干细胞转化为软骨细胞，表面细胞形成透明软骨组织。

此外，间充质干细胞来源的细胞外囊泡(EV)可促进软骨再生，并且降低了异常分化或肿瘤转化的风险，被认为是干细胞移植的替代品[32]。也有很多相关实验采用多种细胞共培养的方式，成本较低、效率较高，包括有成骨细胞与干细胞共培养体系、成骨细胞和软骨细胞共培养体系、以及软骨细胞与干细胞共培养体系等[33-36]，共培养体系中细胞种植比例不同会对研究结果产生各种不同的影响。

异种细胞是从动物组织中获得的细胞，来源广泛，能满足大规模生产的需要，然而，具有一定的免疫风险性[37]。目前，转基因模型已经建立，如果能够免疫反应及人畜共患疾病，异种细胞可以成为种子细胞。

3.2 支架

软骨组织工程技术的支架相当于细胞外基质，应无毒，不引起炎症，孔隙率高，能为细胞生长提供良好的微环境，植入后仍能保持形状[38]。

最早用于软骨组织工程的支架材料是PGA、PLA、PLGA 等[39]。单独使用 PRP 凝胶作为支架，皮下植入后容易挤压变形，特定形态的软骨组织不能形成[40-41]。聚氨酯( PU) 材料可以通过CAD/CAM技术制成具有特定形态的多孔支架[42]。Algul 等[43]利用壳聚糖、海藻酸盐、β—磷酸钙制备了三层支架，动物实验结果表明促进了软骨缺损再生。另有利用 PRP 和软骨细胞混合物置于PU支架中激活形成凝胶结构，在裸鼠皮下可以构建具有特定形态的软骨[44]。改性后的天然高分子凝胶材料能够促进软骨细胞的增殖和分化，甚至可以作为生长因子等的缓释载体[45]。3D打印技术可以用于制备高精度的支架[46-48]，采用低温沉积3D打印技术制备PLGA/DACECM 组织工程软骨支架[49-50]，结果表明支架没有细胞毒性，且具有优异的性能[51]。Lin 等[52]研究也证实这种支架能更好地促进骨髓间充质干细胞的增殖能力，促进新生软骨的形成。

通过整合制备工艺，构建既能募集内源性干细胞，又有利于新生组织成熟，仿生软骨天然微环境及微结构的组织工程软骨支架将是研究的新方向[53]。

3.3 生长因子

生长因子的作用广泛，在软骨组织工程中发挥着重要的调节作用，能够诱导软骨分化[54]。多种生长因子协同作用能增强软骨再生的能力[55]。合适的刺激因子可以诱导软骨定向分化，例如转化生长因 子(TGF-β)[56]、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)[57]、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)[58]、血小板衍生生长因子(PDGF)[59]及肝细胞生长因子(HGF)[60]。有些生长因子能抑制组织工程软骨吸收，如转化生长因子-β1[61-62]。软骨细胞处于存在多种生长因子的微环境中，这些生长因子相互协同作用可促进软骨基质的合成，比如bFGF和IGF-I、bFGF和TGF-β[63]。研究表明，联合应用多种生长因子的效果明显好于单一一种[64]。Moussa 等发现应用富血小板血浆(PRP)细胞治疗促进了软骨细胞的增殖，有助于软骨修复。富血小板血浆(PRP)含有丰富的 PDGF、IGF-1和TGF-β等生长因子，已经广泛应用于运动损伤的治疗[65-66]。

4 展望

患者年龄不同，关节软骨缺损程度各异，那么如何选择相应的治疗方法。针对这个问题，有如下建议：若患者年龄在45岁以下，软骨缺损面积在2 cm2以内，可采用微骨折术。若患者损伤面积大于2 cm2，由外伤或剥脱性骨软骨炎引起，年龄在 15～55 岁之间，并且无系统性感染可进行细胞移植疗法。由于组织工程技术需要支架材料，治疗费用相对高，临床效果好，不受缺损面积影响，术后需较长时间的康复训练，若患者能满足相应条件，可考虑使用。根据传统理论，磨损的软骨不能再生。经过多年的研究和积累，促进软骨组织再生的方法逐步发展，取得了一定的成绩，但目前修复软骨缺损的临床治疗仅是姑息性的，还有许多问题有待解决。例如，影响软骨再生的因素有哪些？修复的最佳材料是什么？体外培养扩增的细胞是否有恶性转化的可能性，生物支架材料是否有毒性和致敏性，疗效是否确定，如何建立组织工程软骨产业化的质量标准。面对软骨再生的困难和未来的挑战，其临床应用前景受到广泛关注。相信随着多学科的融合，这些问题将逐渐得到解决，并将出现更多的软骨再生新技术[67]。