DNA条形码技术及其在法医学中的应用展望

（1.遵义医科大学法医学院，贵州 遵义 563000；2.湄潭县公安局，贵州 湄潭 564100；3.遵义医科大学附属医院司法医学鉴定中心，贵州 遵义 563000）

DNA条形码（DNA barcode）是指在生物体中具有代表性的DNA片段，其有足够的变异，相对较短且容易扩增[1]。DNA条形码技术作为一种新兴的辅助物种分类技术，为分类学研究提供了一个新的方向，在生物学、医药、食品卫生、法医学等领域有着广泛的应用前景[2]。在与法庭科学相关的动植物、微生物以及昆虫学研究中，通过DNA条形码的使用，能够为案件的侦破提供有利的方向，有望在未来的法医学应用中发挥重要作用。

1 DNA条形码技术的概述

2002年4月，德国科学协会就提出了构建包括所有生物种群DNA序列的分类系统的想法[3]；2003年，HEBERT等[4]正式公布了DNA条形码在动物识别中的应用价值，引起了世界各地分类学家的广泛关注。此后，DNA条形码成为生态研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，也为生物学家进一步了解生态系统中的相互作用提供了依据[5]。我国于2005年开始DNA条形码的研究，主要以水蚤、蚊类、寄生虫、吸虫、线虫、粉虱等为主要研究对象，随后拓展到昆虫、渔业、中药材鉴定等多角度多领域的使用[6]。

DNA条形码研究的核心和热点问题主要是对通用序列的筛选和鉴定，在对候选序列的PCR扩增效率和测序质量进行初步评估后，需要对候选序列行进一步的效价评估。判断DNA条形码序列好坏的标准之一是序列是否发生足够多的遗传变异来区分物种，而其内部的变异是足够少的。因此，理想的DNA条形码应该是物种间变异程度大于种内变异程度[7]。结合已成功研究的动物和植物DNA条形码成果，评价种内种间变异的方法主要有遗传距离分析、遗传相似度分析、系统发育树分析、序列特征分析以及统计分类法分析等[2]。迄今为止，已有大量成熟的DNA条形码网站，如国际上的生命条形码数据系统（BOLD，http://www.boldsystems.org/views/login.php）和我国的中国植物志（Flora of China，http://www.efloras.org/flora_page.aspx?flora_id=2）等可供参考使用。

2 DNA条形码技术的原理

DNA是生物遗传信息的载体。由于每个物种的DNA序列都是独特的，DNA条形码可通过测定一段标准的并且在基因组上有足够变异的特定DNA序列来识别此物种。从理论上讲，这种标准的DNA序列对于每个物种来说都是独一无二的。由于每个位点有A、T、G和C 4种碱基，一段长15bp的DNA序列即可编码近10亿个序列。理论上，DNA序列可以编码地球上绝大多数的生物，从而在生物鉴定中发挥作用。

DNA条形码技术是基于传统的DNA序列标记技术，在概念上类似于基因分型，可以现有的基因分析技术为依托，与分类研究、遗传谱系、系统发育有一定的相关性[3]，主要通过对一系列来自不同生物个体的短同源DNA序列进行PCR扩增和测序，然后对被测序列进行比对和聚类分析，以准确定位到一个已描述过的分类种群中[8]。通过GenBank等数据库进行序列比对是DNA聚类分析研究中的一个重要内容，其序列比对软件较多，算法各异，但基于动态规划的多序列比对问题仍然十分复杂，不同算法的可靠性还需进一步验证，而且数据预处理与特征提取对聚类分析影响较大。聚类算法基于其分类不同，随着大数据和人工智能的发展，聚类算法应用广泛，但同时要求更高，仅选择一种聚类算法可能无法适用数据集的复杂性和多样性。因此，需要在了解基本聚类算法优缺点的基础上，研究多种算法的融合问题[9-11]。对于某些物种，现已知的结构特征已足够将其定位到特定的地理种群[12]，便于分析和归类。

3 DNA条形码技术的优势和局限性

DNA条形码技术作为一种标准的物种鉴定方法，操作步骤简单快速，具有广泛的应用前景。当传统的分类困难时，这种技术就更可以发挥其优势[13]。

DNA条形码技术的优点主要体现在如下几点：（1）DNA条形码技术是传统识别技术的有效补充。传统的分类学对一些形态相似的植物、部分中草药的分类较为困难，而DNA条形码技术可以不受形态、大小、完整性等理化因素的影响，直接从基因水平对物种进行快速鉴定，如余亚东等[14]使用ITS2序列对白术与苍术及其混伪品进行了有效区分，避免了因形态学鉴定造成的误差。这显示了DNA条形码具有较高的准确性，是分子生物鉴定的最新发展方向，特别是在传统手段无法鉴定的卵和幼虫以及动植物寄生虫等方面，可以发挥独有的优势[15-16]。（2）建立统一的DNA条形码数据库，有利于物种鉴定的规范化。（3）通过DNA条形码数据库的建立，可快速识别大量样本，从而促进分类学的快速发展。（4）DNA条形码技术有利于新物种的开发利用。随着濒危动植物的增多，寻找新的可替代资源已经成为一个重要的方向。在许多药用动植物中，DNA条形码技术有利于寻找化学结构相似、亲缘关系较近、药性药效差别不大的新药源，有利于新物种的开发和利用。（5）DNA条形码技术有利于生物多样性的保护。在快速完成物种区别和鉴定的同时，DNA条形码技术也可以发现新物种和隐匿种，并且可以重建物种和高级分类阶元的演化关系[17]。（6）DNA条形码技术有助于缓解专业人员短缺的现状。DNA条形码技术程序固定、操作简单，鉴定人员只需经过短期培训即可通过构建的DNA条形码数据库进行数据比对，缓解了目前鉴定人才缺乏的状况。（7）DNA条形码技术可为物种的流通管理带来新的变革。DNA条形码使用二维码作为DNA序列的信息载体，并利用目前已普及的扫描功能的通信终端以及全面覆盖的无线网络技术，促使待鉴定物种的信息收集与传输都变得更加简单、快捷[18]。DNA条形码技术作为一种新的物种识别方法，能够以一种移动的方式实现物种信息的采集和识别，是一种理想的物种鉴别技术，必将为未来物种的鉴定带来便利。

当然，DNA条形码也存在一些局限性。地球上物种繁多，有效数据资料匮乏，而被DNA条形码编码的数据资料更少。首先，针对不同的鉴定目的，条形码基因组区域的选择不同。不同物种及同种亚型DNA条形码的选择差异也较大，如COⅠ基因对动物物种鉴定而言是一个有效的DNA条形码基因，植物DNA标准条形码的核心基因片段是rbcL/matK，真菌则是ITS基因。针对物种的特异性可选择不同的DNA片段来进行种属鉴定。不同区域的进化保守程度不同，采用单一基因片段鉴定有限，必要时可联合使用多个DNA片段、多种方法综合鉴定[19-20]。其次，由于世界各地科学家使用的扩增引物不统一，得到的部分数据有差别，不具有可比性，难以起到物种比对鉴定的目的[15]。另外，由于不同国家的科学家对物种的命名有差异，导致数据库中资料混杂，在实际应用中也会引起混淆，给鉴定工作带来困难。但是，通过建立统一的DNA条形码联盟和DNA条形码网站，可对优化DNA条形码技术的应用起到积极的作用。

4 DNA条形码技术的法医学应用前景

在法庭科学的种属鉴定中，传统的形态学、血清学和广泛应用的商品化胶体金试剂条法都有各自的不足，在实际案件应用中不太理想。DNA条形码技术作为物种鉴定的最新技术，在与法医学鉴定有关的动植物、微生物、昆虫以及其他方面可为法庭科学中涉及的非人类DNA鉴定提供新途径和新思路。

4.1 与法医学鉴定有关的动植物

随着分子技术的发展，DNA条形码技术弥补了动植物学主要依靠形态和性状进行分类鉴定的不足。DNA条形码技术作为分子鉴定的最新发展，其技术成熟，能够客观、准确、快速地进行物种鉴定。与法医学鉴定相关的有毒动植物来源广泛、种类繁多。我国目前已发现的有毒动物有上百种之多，常见的毒蛇、毒蜘蛛、蜈蚣、蜂以及可食用的河豚、斑蝥、蟾蜍等动物所含的毒素进入人体可引起中毒，甚至死亡[21]。在对这类物种进行鉴别时，往往依靠患者描述或者医生经验进行推断，具有一定的局限性，同时有些毒素在体内释放快，神经毒性、循环毒性扩散快，危险大，需要尽快判断，抢救生命。在疑为有毒动物中毒的案例中，搜集可疑动物标本进行检测及物品识别，判断有毒动物种类、性质、来源与归属，协助法医鉴定，将在法庭审理中起到很好的协助作用[22]。在法医学鉴定中涉及可疑植物中毒分析时，依靠性状或显微观察结果有很大的局限性，且费时费力，若能凭借植物DNA条形码数据库，可实现快速检索和鉴定，并与案件调查相结合，进行综合分析判断[23]，有利于查清案件事实，为案件的快速侦破提供保障。宏条形码（metabarcoding）技术是综合DNA条形码和高通量测序方法快速评估生物多样性的新技术，可对浮游植物进行快速准确的鉴定[24]。在溺死案件中，对硅藻的种属鉴定可对死亡原因以及入水地点进行鉴定，是法医学实验室诊断溺死的金标准[25]。若能将DNA条形码技术与硅藻种属鉴定相结合，必然能够缩短检验时间，提高鉴定精准度，为案件侦破提供有利帮助。此外，在交通肇事案件中，植物DNA条形码也可发挥重要作用，提供可靠的鉴定意见[26]，协助案件快速侦破。

4.2 与法医学鉴定有关的微生物

人体内外存在着大量的微生物，在漫长的进化过程中，双方形成了互利共生的关系[27]。不同的身体部位有着不同种类的微生物，微生物在不同个体间也因年龄、性别、饮食、职业、卫生习惯甚至个体基因的差异有所不同。传统的微生物鉴定主要用于流行病学调查，随着案犯反侦察能力的提高，为追踪犯罪者的法庭微生物学应运而生。2015年美国哈佛大学研究表明，人类的微生物，特别是胃肠道微生物，有可能成为指纹识别工具；随后发表在Proceedings of the National Academy of Sciences上的一项研究发现，每个人都有一个独特的“微生物聚居群”，可以用来进行身份鉴定[28]。有学者[28-29]认为，无需人类DNA，利用人体微生物的DNA序列也有可能形成同样的关联，可应用于法医学鉴定。由于细菌和人体之间的密切关系，当犯罪嫌疑人作案后，遗留在现场的微生物和其指纹一样，是独一无二的。研究[30-32]结果发现，人手上的细菌不受温度、湿度和紫外线的影响而改变。因此，当现场的常规生物检材无法提供有效的信息时，可以利用嫌疑人遗留在现场的细菌谱进行DNA分析，并与嫌疑人身上或者手上的微生物谱进行比对，为追踪犯罪嫌疑人提供科学依据。

由于中国的近亲属常呈聚居式生活，具有相同的生活环境和饮食习惯，皮肤表面的微生物可具有一定的相似性。在实际检案中，除了可以利用微生物的DNA条形码进行犯罪嫌疑人的相关信息分析，也可以根据检测到的微生物群进行相关亲属的比对。检测相近微生物株间可靠变异，推测特定微生物来源、亲缘关系或传播途径，可为缩小侦查范围提供有利的证据[33]。

此外，不同的土壤、植物可孕育出不同的微生物，自然界中的土壤-植物-微生物具有相互作用[34]。在刑事案件中，对遗留在现场或者无名尸体上的微生物可通过DNA条形码技术进行检测，判断其优势菌落组成，对寻找第一案发现场提供方向，可大大缩短侦查范围，提高破案效率。另外，对死后尸体上微生物的代谢变化，利用DNA条形码技术检测其微生物简单易行、快速准确，可为死亡时间、死亡地点提供科学依据。

4.3 与法医学鉴定有关的昆虫

昆虫证据在案件侦破和法庭审判中起到不可忽略的作用[35]。昆虫的种类、发育历期、地理分布、适生场所、行为规律等都可以用来推断死亡时间、死亡地点、死亡原因等，为案件的调查提供有利方向。对法医学有意义的昆虫主要有双翅目昆虫、鞘翅目昆虫、鳞翅目昆虫、膜翅目昆虫以及其他节肢动物等[36-37]。由于死亡现场的昆虫标本采集通常受到土壤、地形、植被等因素的影响，加之破案时间短、牵涉范围广、任务重以及技术人员专业知识有限，容易影响鉴定意见的准确性，同时，由于亲缘关系比较近的物种因化学成分相似而难以区分，尤其是一些虫卵、幼虫等难以使用传统的方法进行有效鉴别[38]。与传统的鉴定方法相比，DNA条形码技术用较短的、标准的DNA片段作为遗传标记进行物种鉴定，不受个体大小、生长阶段及组织细胞完整性的影响，能直接从基因水平提供丰富的鉴定依据[39]。翟仙敦等[40]使用DNA条形码技术对5种嗜尸性麻蝇进行分类，其鉴定结果与形态学鉴定结果一致。由此可见，DNA条形码作为传统形态学的重要补充，在法庭科学DNA鉴定中具有实用价值。

4.4 法庭科学中的其他应用

法庭科学的目的是从证据链中提取相关信息，使发生的事件得以精确地重现，确保案件的真实客观性。明确检材的种属分类至关重要，能为案件侦查提供线索以及案件审理提供证据[41-42]。随着生命条形码数据库的不断补充，在一些如违法捕杀和买卖受保护濒危动植物的案件中，明确该动植物的保护级别，对维护经济市场稳定有较大作用[43]，DNA条形码技术的实用性也愈发明显。另外，在国境口岸可利用DNA条形码技术对病媒生物、疫病疫情进行防控，解决生物犯罪，保障国家安全[44]。还可利用DNA条形码技术对海关贸易进行监测，保障进出口贸易安全有序进行[45]。目前，已有DNA条形码技术与DNA芯片相结合的实际应用案例，为建立高通量、低成本、快速、准确、灵敏的成套检测技术奠定了基础，显示了该技术良好的应用前景[46]。

DNA条形码技术不仅促进了传统分类学研究的发展，同时也加快了生物资源的鉴别、收藏工作，推进了生物资源的合理利用。法医学作为法律与自然科学的交叉学科，在利用其他学科成熟技术的前提下，必然也会得到相应的发展和提高。随着二代测序所伴随的大量数据的产生，法庭科学中的DNA条形码技术也会得到重视，有望在未来的法医学实践中发挥重要的作用。