富含1-脱氧野尻霉素的家蚕品种萃华的选育方法

马 欣 刘 萍 卜黎明 黄俊逸

(1河南省蚕业科学研究院，河南郑州 450008； 2上海大学生命科学学院天然产物研究中心，上海 200444)

自古以来家蚕就是公认的滋补食疗珍品[1]，《齐民要术》《天工开物》《神农本草》《本草纲目》《中国药物》等都记载了家蚕的药用价值[2]。现代研究表明，蚕体含有调节血糖的有效成分1-脱氧野尻霉素(Deoxynojirimycin，DNJ)[3-4]，但利用不同家蚕品种所制作的全蚕粉，其药用、食用价值存在一定的差异[5]。施新琴[6]、沈以红等[7]研究认为，家蚕地理系统和品种的不同均会影响DNJ的富集。2014年春季，河南省蚕业科学研究院在彩色茧育种材料的成分检测中发现，绿色茧育种材料007富含DNJ，并经过6年11代的系统选育和DNJ指标检测，选育出富含DNJ的家蚕新品种萃华。因萃华在育种选择时不需要考虑丝质，简化了选育过程，在生产上不需要考虑5龄后期的饲育、上蔟、采茧、收烘和缫丝等工作，节省了时间、人力、物力和财力，经济效益比丝茧育有所提高。目前国内尚未制订特殊用途家蚕品种的审定标准，一定程度上制约了此类品种的选育与开发。现将萃华选育的有关情况报告如下，供同仁参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试亲本 试验蚕品种：育种材料007、009B、伊川3眠、黄茧，均是由河南省蚕业科学研究院经过多年系统选育得到的彩色茧育种素材。其中007的5龄期营养成分检测发现富含DNJ，总黄酮含量测定高于其他彩色茧育种材料，但体质稍差，全茧量1.50 g左右；009B蚕茧颜色金黄色，伊川3眠蚕茧颜色桔红色，黄茧蚕茧颜色黄色。对照蚕品种：菁松A和皓月A，中国农业科学院蚕业研究所选育[8]，为现行推广的强健好养家蚕品种，杂交配合力优良。所有蚕品种均由河南省蚕业科学研究院繁育提供。

1.1.2 主要仪器设备 LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；Scientz-10N型冷冻干燥机，浙江新芝生物科技股份有限公司产品；CW1-8-QA型超微粉碎机，山东烟台慧宝设备制造有限公司产品；HWS-24型恒温水浴锅，上海慧泰仪器制造有限公司产品；UV-1600PC型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司产品；AL204型电子天平，梅特勒-托利多上海有限公司产品；3K15型离心机，德国Sigma公司产品。

1.1.3 主要试剂 乙腈、甲醇、石油醚、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、亚硝酸钠、三氯化铝、蒽酮、乙酸乙酯、蔗糖、芦丁、甘氨酸、Folin酚均为分析纯，购自国药化学集团试剂有限公司；芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；DNJ标准品，上海诗丹德标准技术服务有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 新蚕品种杂交组合的选育 (1)选育目标。选育出富含DNJ的家蚕品种，强健易繁，药食兼用，饲育过程中具有孵化齐一、眠起齐一、食桑活泼、龄期经过短和生命力强等优点。(2)选育经过。2014年春季，对不同茧色育种材料桑叶饲育至5龄第3天停止食桑，12 h后将家蚕冷冻干燥，然后进行DNJ含量的检测，结果显示绿色茧育种材料007富含DNJ(表1)。因此，以绿色茧育种材料007的雌性亲本分别与现行蚕品种菁松A和皓月A的雄性亲本杂交，获得2个杂交组合F1代，结淡绿色蚕茧。2014年秋蚕期后代开始自交，F1～F4蛾区混合育，采用多卵圈混合育个体选择技术，F2代出现茧色分离，白色茧∶淡绿色茧∶绿色茧=1∶2∶1，每代选留绿色蚕茧的雌、雄蛾各25头，随机交配留种，每代选择卵量多、不良卵少、卵色基本一致、转青齐的蛾区为收蚁蛾区，2015年春蚕期F3代茧色为淡绿色和绿色，至2017年春蚕期F7代茧色全部为绿色。F5～F8单蛾育同蛾区交配，每代饲育6区，各蛾区4龄饷食1 d后将饲育头数调整为200头左右，以绿色茧色为主进行蛾区选择，确定2蛾为留种蛾区，在留种蛾区进行肉眼观察，手触粗选和个体称量精选，进行单茧调查，全茧量控制在入选区平均值以上。F9～F11单蛾育，每代饲育6区，1～2龄采用薄膜全密闭育(全覆盖)，3龄半覆盖育，4～5龄普通育。全龄每昼夜给桑4次，按标准温湿度饲育。饲育过程中，及时淘汰弱小蚕、迟眠蚕和迟熟蚕。以4龄起蚕虫蛹率调查数据为主，全茧量控制在平均值以上，选取2个蛾区进行异蛾区交配，留种28蛾。至2018年春季培育出富含DNJ的中系蚕品种萃华E和富含DNJ的日系蚕品种萃华A。2个新品种的选育系谱成绩如表2-3所示。将2个新品种组配成二元杂交组合萃华E×萃华A，定名为萃华。

表1 家蚕不同茧色育种材料的各有效成分含量%

表2 富含DNJ的家蚕日系品种萃华A选育系谱成绩

表3 富含DNJ的家蚕中系品种萃华E选育系谱成绩

1.2.2 新蚕品种杂交组合的实验室鉴定 2018年和2019年春季在河南省蚕业科学研究院对新蚕品种二元杂交组合萃华进行了2期饲养鉴定，以全国现行春用多丝量蚕品种菁松×皓月为对照，4月30日收蚁，用电子秤称量各品种蚁蚕1 g混合饲育，收蚁和各龄期起蚕消毒均用湖州宝成蚕业用品有限公司生产的中草药防病一号。收蚁后的小蚕采用塑料薄膜覆盖育，饲育温度1～2龄期26～27 ℃，3～5龄期25 ℃。5龄食桑3 d后，拾蚕放入空匾中，停食并排除蚕粪1 d，置于-18 ℃冰柜中速冻。冷冻2 d后，取出速冻家蚕平铺装入低温冷冻干燥机的干燥盘内进行冷冻干燥。干燥后置于CW1-8-QA型超微粉碎机中粉碎，粉碎后装入干净瓶中放入4 ℃冰箱保存，用于营养成分分析与检测。

1.2.3 新蚕品种杂交组合DNJ含量的测定 参考文献[9]的方法采用高效液相色谱荧光检测法(HPLC法)测定样品中DNJ的含量。称取供试样品粉1.0 g，按1∶280的质量比加入0.05 mol/L盐酸溶液，于72.9 ℃恒温水浴浸提2 h，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，重复提取2次，合并上清液，加蒸馏水定容DNJ提取液至50 mL，备用。取上述提取液10 μL，加入0.20 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.5)10 μL混合，再加入浓度为5 mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液20 μL，迅速混匀，30 ℃水浴反应30 min，之后加入0.10 mol/L甘氨酸10 μL，终止反应。用0.22 μm一次性灭菌过滤器过滤后用HPLC方法分析。

色谱条件：Inertsil ODS-SP色谱柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%乙酸混合相(体积比55∶45)，流速1.0 mL/min；柱温28 ℃；荧光检测器激发波长254 nm，发射波长322 nm。重复3次，取平均值。

1.2.4 新蚕品种杂交组合总黄酮含量的测定 总黄酮含量的测定参考吴佳雯等[10]的方法进行测定。称取样品粉末约1.0 g于100 mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇40 mL浸提2 h，然后8 000 r/min离心15 min，过滤得滤液，滤渣再重复提取2次，合并滤液后真空浓缩，浓缩物用去离子水复溶至10 mL，储存于4 ℃冰箱中备用。取0.1 mL适当稀释过的样品提取液于10 mL试管中，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀后放置6 min，加入10%三氯化铝0.3 mL，摇匀再放置6 min，加入4%氢氧化钠4 mL，最后用纯水定容至25 mL，静置10 min，测其510 nm波长处的吸光度。以芦丁为对照所获得的回归方程为Y=0.012 37X+ 0.001 71(Y为510 nm处的吸光度，X为芦丁浓度)，R2=0.999 95。样品中总黄酮的含量，按照下列公式进行计算：

(X：标准曲线得出的总黄酮含量，单位为mg/mL；V：测量时样品的体积，单位为mL；N：样品提取液稀释倍数；m：样品干质量，单位为g)。

1.2.5 新蚕品种杂交组合蛋白质和脂肪含量的测定 样品中蛋白质含量的测定参考邓丽莉等[11]的方法测定。样品中脂肪含量的测定参照徐泽平等[12]的方法测定。

1.2.6 新蚕品种杂交组合可溶性总糖含量的测定 样品中可溶性总糖的提取与含量测定参照丁雪梅等[13]的方法。称取0.1 g样品于离心管中，加入5 mL蒸馏水沸水浴提取30 min。提取过滤液于25 mL容量瓶中，定容至刻度。吸取上清液0.5 mL，加蒸馏水至2 mL，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试剂，最后加入5 mL浓硫酸，按照蔗糖的标准曲线的方法，于630 nm处测定吸光度，平行3组。利用蔗糖作为标准品，获得的标准曲线方程为Y=0.008X-0.002(Y为630 nm处的吸光度，X为可溶性糖浓度)，其中R2=0.985。样品中可溶性总糖含量，按照下列公式计算(其中样品的质量按干物质记)：

(X：标准曲线得出的可溶性总糖含量，单位为μg/mL；V：提取液总体积，单位为mL；N：样品提取液稀释倍数；m：样品的干质量，单位为g；0.5：测定时所用样品的体积数)。

1.2.7 数据分析 所有试验均设置3个重复，应用数据分析软件SPSS 22.0进行试验数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 萃华的实验室鉴定成绩

从表4可以看出，试验蚕品种萃华幼虫发育经过与对照蚕品种菁松×皓月相仿，5龄第3天蚕体干质量与菁松×皓月无显著性差异，说明在相同饲育环境条件下，萃华接近菁松×皓月的水平。

表4 试验蚕品种萃华的实验室鉴定成绩

2.2 萃华的各营养成分含量

从表5可以看出：试验蚕品种萃华的蚕体内DNJ含量为0.750%，与对照蚕品种菁松×皓月(0.523%)相比高0.227个百分点；总黄酮含量为1.793%，与菁松×皓月(1.802%)相仿；蛋白质含量为61.00%，与菁松×皓月(78.80%)相比低17.80个百分点；脂肪含量为9.50%，与菁松×皓月(12.30%)相比低2.80个百分点；可溶性总糖含量达到8.20%，比菁松×皓月(5.00%)高3.20个百分点。

表5 试验蚕品种萃华的各有效成分含量%

2.3 萃华原种及杂交组合的主要性状

2.3.1 萃华E原种性状 中国种系统，茧色绿色，孵化齐一，壮蚕素蚕，体色青黄，腹足泛绿，春季幼虫5龄第3天冷冻干燥，DNJ含量为0.683%，5龄经过8 d 6 h，全龄经过24 d，4龄起蚕虫蛹率98.04%。

2.3.2 萃华A原种性状 日本种系统，茧色绿色，孵化齐一，壮蚕普斑，体色青黄，腹足泛绿，春季幼虫5龄第3天冷冻干燥，DNJ含量为0.763%，5龄经过8 d 6 h，全龄经过23 d 12 h，4龄起蚕虫蛹率96.40%。

2.3.3 萃华杂交组合性状 二元杂交组合，卵色呈灰绿色，卵壳呈淡黄色，克卵粒数1 750粒左右，克蚁头数2 100头左右。孵化齐一，易于繁育。饲育过程中眠起齐一，食桑较旺，体质强健。5龄幼虫普斑，蚕体粗壮，腹足呈半透明淡绿色。催青经过11 d，全龄经过22～23 d，全茧量1.66～1.76 g，4龄起蚕虫蛹率94.31%～96.89%，幼虫5龄期总黄酮含量高，富含DNJ。

3 小结与讨论

DNJ是一种天然呱啶生物碱，最早由YOHJI从桑根和桑枝中分离获得[14]。贺伟强等[14]测定桑叶中DNJ含量为0.110 0%，家蚕以桑叶为饲料，其DNJ含量为0.448 0%，是桑叶中DNJ含量的4倍多，具有积累或合成DNJ的生理机能。何行健等[15]测定oex黄血高度油蚕全蚕粉中DNJ的含量为0.482 5%，略高于对照蚕品种皓月A的0.446 5%。朱红等[16]研究表明,全蚕粉含DNJ的质量分数为0.523 2%,是桑叶中DNJ含量的4倍多。由此分析：DNJ来源于桑叶，家蚕体内能富集DNJ；而且品种间富集DNJ的能力存在一定的差异，本次试验也发现在彩色茧育种材料中绿色茧品种007的DNJ含量较高，说明通过品种改良能提高DNJ在家蚕体内的富集。

在彩色茧品种中，绿色茧品种家蚕体内的总黄酮含量较高，本次试验也表明育种材料007的蚕体内总黄酮的含量达到2.385%，明显高于金黄色茧品种009B(1.279%)和黄茧品种(1.576%)。贺伟强等[14]研究黄酮类化合物是一类小分子的天然活性物质，具有降血糖、消除氧自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保肝、保护心脑血管系统、抗病毒等生理活性，并且毒副作用小。陈智毅等[17]研究表明，蚕体粗蛋白质含量(干物)达60.87%，高于牛奶(29.41%)和鸡蛋(52.48%)，并且含有各种人体必需氨基酸，极易被人体吸收，不易引起胆固醇升高，是一种全价、优质、完全的动物蛋白质。

综上所述，家蚕药食兼用，用富含DNJ的家蚕品种萃华生产全蚕粉，用于糖尿病的预防与改善，具有潜在的市场前景。