YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌组织中的表达及意义①

黎超莲，农海斌，卢昱超，彭园园，周英琼，徐龙宽

(1.桂林医学院临床医学院,广西 桂林 541001；2.桂林医学院附属医院病理科，广西 桂林 541001)

鼻咽癌是我国南方省份及东南亚高发的一种恶性肿瘤，有明显的种族聚集性和地域性,每年的发病率15～50/100 000人[1]。有研究表明，鼻咽癌的发生是一个多阶段、多途径、多机制的过程。各种环境因素、EBV感染、遗传和表观遗传学的改变导致癌基因过表达及抑癌基因表达下调或缺失，经过癌前病变，最终发展成鼻咽癌[2]。目前放疗或放化疗同步是其主要治疗手段，治疗后局部复发和远处转移仍是鼻咽癌治疗失败的主要原因，5年生存率45%左右。放疗的多药耐药性影响了鼻咽癌患者的放疗效果和生存质量[3]。近几年，基因靶向治疗在肿瘤学上关注度很高，因此，发现特异性的肿瘤标志物应用于临床早期诊断、干预以及治疗具有重要意义。Yes激酶相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)、转录联合激活因子(The transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)是Hippo信号通路的重要成员，主要参与调节器官的发育，并且与肿瘤的形成有关[4]。近年来大量研究发现，YAP、TAZ表达水平的升高或核移位，可见于人类各种系统肿瘤，较为常见的有乳腺癌[5]、卵巢癌[6]、胃癌[7]等，且敲低YAP、TAZ的表达可以阻止肿瘤细胞的进一步转移，甚至改善预后。YAP、TAZ的表达水平在某些恶性肿瘤中可以作为独立预后指标之一[8]，且Hippo信号通路可能影响肿瘤对化疗药物的敏感性，临床上可通过干预该通路以提高肿瘤的治疗效果，提高患者的生存率[9]。β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt(wingless-type MMTV integration site family members)信号通路中的重要成员，β-catenin作为Wnt信号通路的关键调节因子，兼有胞间连接和信号传导的功能[10]。笔者阐述了YAP、TAZ、β-catenin三者在鼻咽癌中的作用及其相互关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料

收集桂林医学院附属医院病理科2009年1月至2013年12月存档的100例鼻咽癌组织蜡块作为实验组，另取同期非肿瘤鼻咽黏膜组织30例作为对照组。所有患者术前没有经过临床的化学治疗以及生物治疗，且临床及病理资料完整。100例鼻咽癌患者年龄13～75(47.5±13.2)岁，其中<50岁56例，≥50岁44例，根据TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期86例，Ⅲ～Ⅳ期14例。病理分型：非角化性未分化型癌92例，非角化性分化型癌8例。

1.2 实验方法及试剂

本实验所纳入的组织标本均使用以下方法处理：①10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。②4.0 μm连续切片，常规脱蜡至水后，EDTA(pH 8.0)高压修复抗原；PBS冲洗。③PBS冲洗3次，3 min/次，后用H2O2浸泡10 min；PBS冲洗3次，3 min/次；滴加羊血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，稀释倍数 1∶10)，置于37 ℃温箱中封闭30 min。④滴加一抗，PBS冲洗3次，3 min/次，后滴加二抗，室温放置15 min。⑤PBS冲洗3次，3 min/次，然后用DAB(购自福州迈新生物技术开发有限公司)显色。⑥苏木精复染。⑦中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以阳性表达的乳腺癌组织为阳性对照。鼠源性YAP单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，稀释浓度为1∶200；兔源性TAZ多克隆抗体购自武汉尚恩生物技术有限公司，稀释浓度为1∶1 000；兔源性β-catenin多克隆抗体购自武汉博士德生物公司，稀释浓度为1∶200；即用型免疫组化Eli Vision TMsuper试剂盒(鼠/兔)和免疫组化一抗稀释液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 判断方法与标准

每张切片在光镜下随机选取5个视野，每个视野记数100个细胞。判断标准：①按阳性着色程度评分：0分为无着色，与背景色一致；1分为稍浅黄色，比背景颜色略深；2分为棕黄色，明显比背景色深；3分为棕褐色。②按阳性细胞所占比例评分：0分为阴性；1分为10%以下；2分为11%～50%；3分为51%～75%；4分为75%以上。每张切片以两者乘积判定阳性结果：0～2分为阴性(-)；3～4分为弱阳性(+)；5～8分为中度阳性(++)；9～12分为强阳性结果(+++)，将≥3分定为阳性结果，<3分定为阴性结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，计数资料用%表示，差异性分析采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。采用χ2检验对YAP、TAZ之间的相关性进行分析。

2 结果

2.1 YAP、TAZ、β-catenin在不同组织中的表达

YAP、TAZ以细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性表达，β-catenin在非肿瘤鼻咽黏膜组织中主要以细胞膜着色为主，而在鼻咽癌组织中除了细胞膜着色还出现细胞浆的异位表达(见图1)。实验组100例鼻咽癌组织中，YAP、TAZ、β-catenin的阳性例数、阳性表达率分别为91(91.0%)、64(64.0%)、81(81.0%)。30例非肿瘤鼻咽黏膜组织中，YAP、TAZ、β-catenin的阳性例数、阳性表达率分别为10(33.3%)、1(3.3%)、12(40.0%)。YAP、TAZ在鼻咽癌组织的阳性表达率显著高于非肿瘤鼻咽黏膜组织(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌组织中的异位表达率明显高于非肿瘤鼻咽黏膜组织(P<0.05)。详见表1。

表1 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌组织、非肿瘤鼻咽黏膜组织中表达(n，%)

A、B：YAP在非肿瘤鼻咽黏膜组织、鼻咽癌组织中的表达；C、D：TAZ在非肿瘤鼻咽黏膜组织、鼻咽癌组织中的表达；E、F：β-catenin在非肿瘤鼻咽黏膜组织、鼻咽癌组织中的表达

图1 非肿瘤鼻咽黏膜组织、鼻咽癌组织中YAP、TAZ、β-catenin的表达(SP×200)

2.2 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌中的表达及与临床病理参数间的关系

YAP、TAZ在鼻咽癌组织中的阳性表达率与鼻咽癌的病理分型有关(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌组织中的异位表达率与鼻咽癌的病理分型有关(P<0.05)；TAZ在鼻咽癌中的阳性表达率与性别、5年生存率有关(P<0.05)，而与年龄、临床分期、有无远处转移、淋巴结转移无显著关系(P>0.05)；YAP、β-catenin在鼻咽癌中的异常表达率与性别、年龄、临床分期、有无远处转移、淋巴结转移、5年生存率无显著关系(P>0.05)。详见表2。

表2 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌组织中的表达及与临床病理参数间的关系(n)

2.3 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌组织中的表达相关性分析

在91例YAP阳性表达组中，YAP、TAZ共阳性表达61例，在9例 YAP阴性表达组中，YAP、TAZ共阴性表达6例，χ2检验提示在鼻咽癌组织中，YAP与TAZ蛋白在鼻咽癌中的表达成正相关(P=0.045)；YAP、TAZ表达与β-catenin蛋白异位表达成正相关(P<0.05)。详见表3。

表3 YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌组织中的表达及其相关性分析

3 讨论

在哺乳动物中YAP和TAZ是Hippo通路的下游效应分子，YAP基因定位于人类染色体11q22，在正常生理状态下广泛表达于机体组织中。TAZ也被称为WWTR1，TAZ与YAP同源，两者之间有46%氨基酸序列是相同的[11]。Hippo信号通路调控肿瘤发生，YAP、TAZ高表达广泛出现于多种恶性肿瘤中，YAP、TAZ被看作是致癌因子，针对肿瘤中的YAP、TAZ，目前研究YAP、TAZ抑制剂已成为一种必然的趋势，Li等[12]研究发现在肝星状细胞中，异甘草酸镁能通过抑制Hippo通路以达到控制炎症的作用。杨生辉等[13]通过Western blot、免疫荧光实验等方法检测科罗索酸对肺癌细胞株A549中YAP蛋白定量和定位的影响，结果显示科罗索酸能明显抑制肺癌细胞株A549中YAP蛋白的表达从而抑制肺癌细胞的增殖并促进其凋亡。开发更加高效特异的YAP、TAZ 抑制剂将对肿瘤的临床治疗提供极大的帮助。

近些年来，对Hippo通路促进肿瘤形成的发生机制的研究越来越多，YAP、TAZ是如何促进肿瘤的形成？综合国内外的研究发现，在肿瘤中Hippo通路和Wnt/β-catenin通路有密切联系，共同调节肿瘤的形成。众多研究表明Wnt/β-catenin是致癌通路，当Wnt信号通路异常活化时会促使肿瘤发生[14]。有研究表明，Hippo通路和Wnt/β-catenin通路在不同的细胞中有不同的相互作用，在心肌细胞中，YAP与β-catenin相互促进调节基因表达，以控制心脏大小、肿瘤细胞的转化与稳定；而在肝细胞癌中，Wnt/β-catenin通过抑制YAP、TAZ的活性，从而促进肿瘤的发生[15]。温宗华等[16]研究发现，β-catenin、Survivin在鼻咽癌组织中存在异常表达，且两者在鼻咽癌的发生发展中起到协同促进作用。本实验研究发现 β-catenin在鼻咽癌组织中存在细胞浆异常表达，且YAP、TAZ与β-catenin蛋白异位表达成正相关。

本研究结果显示，YAP、TAZ在鼻咽癌组织的阳性表达率显著高于非肿瘤鼻咽黏膜组织(P<0.05)；β-catenin在鼻咽癌组织中的异位表达率明显高于非肿瘤鼻咽黏膜组织(P<0.05)，且YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽癌组织中的异常表达率与鼻咽癌的病理分型有关(均P<0.05)。8例非角化性分化型癌组织中YAP、TAZ、β-catenin的阳性表达率分别为62.5%、25.0%、37.5%，而92例非角化性未分化型癌组织中YAP、TAZ、β-catenin的阳性表达率分别为93.5%、67.4%、84.8%(均P<0.05)，提示YAP、TAZ、β-catenin可能与鼻咽癌的病理分化过程、发生进展密切相关，这三者在鼻咽癌组织中的异常表达可能导致鼻咽部肿瘤的形成。但由于非角化性分化型癌例数较少，YAP、TAZ、β-catenin的异常表达率与鼻咽癌病理分型呈正相关或负相关，有待进一步研究。TAZ在鼻咽癌中的阳性表达率与5年生存率有关(P<0.05)，提示TAZ蛋白的异常表达与鼻咽癌患者的预后有关，但具体相关性有待进一步行蛋白定量研究。

通过对YAP、TAZ、β-catenin在鼻咽部组织中的研究，结果提示YAP、TAZ高表达、β-catenin异位表达在鼻咽癌中起致癌作用，给我们提供一个思路，是否可以通过抑制YAP、TAZ蛋白的表达水平、抑制β-catenin的异位表达，用于预防肿瘤的形成、抑制癌组织进一步恶化，或通过检测YAP、TAZ、β-catenin的表达水平以达到鼻咽癌早期筛查、治疗及评估预后的作用。这为鼻咽癌的临床诊断和治疗、为开发YAP、TAZ抑制剂提供了可供参考的理论基础，为鼻咽癌基因靶向治疗药物开发提供参考的理论依据。