继发性不孕患者卵泡液25-（OH）D水平与IVF卵母细胞发育关系的研究

贾新转，王聪敏，刘二缓，张娜，魏兰

人体内的维生素D 主要循环形式是25-羟基维生素D［25-（OH）D］，活性形式为1，25二羟维生素D［1，25（OH）2D］。1，25（OH）2D与细胞内维生素D受体结合，其复合物穿过细胞核，作为转录因子与特定基因结合发挥作用。人类性腺组织和生殖器官中存在维生素D受体。人类维生素D结合蛋白具有遗传多态性［1］，不同种族间维生素D 结合蛋白的表型不同［2］。敲除维生素D受体的小鼠不能产生成熟卵母细胞，表明维生素D 对小鼠卵泡发育至关重要［3］。然而，维生素D在卵泡发育过程中的作用尚不清楚。体外受精（in vitro fertilization，IVF）可观察卵泡发育、卵母细胞受精、胚胎发育、着床以及最终的临床结局，为研究卵泡内维生素D 水平与卵母细胞发育的关系提供了独特的条件。近年来有学者报道，卵泡液25-（OH）D 水平可影响IVF 的临床结局，如植入率、临床妊娠率和活产率，但研究结论各不相同，推测可能与研究人群的种族不同有关［4-5］。目前IVF临床妊娠率为50%左右［6］，影响IVF 妊娠结局的因素主要为胚胎质量和子宫内膜容受性。本研究旨在探讨继发性不孕且需行IVF 治疗的女性卵泡液25-（OH）D水平与卵泡发育、卵母细胞成熟、胚胎质量及临床结局是否相关，为提高IVF 临床妊娠率提供新思路。′

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019 年6 月—9 月在河北医科大学第四医院生殖中心初次就诊且需进行IVF的192例继发性不孕患者作为研究对象。纳入标准：既往有妊娠史，而后无避孕连续12 个月未孕且需行IVF 治疗。排除标准：（1）男方因素所致继发性不孕。（2）男方或女方有吸烟、酗酒史。（3）高血压、糖尿病、自身免疫性疾病、甲状腺功能异常、恶性肿瘤。（4）重要脏器（如心、脑、肺、肝、肾等）疾患。（5）入组前3个月内补充维生素D 及芳香化酶抑制剂。入组患者年龄24～32岁，平均（27.99±2.85）岁。根据继发性不孕原因分为4组：输卵管因素组（慢性输卵管炎症、输卵管阻塞）58例、子宫内膜异位症组［依据2013 年欧洲人类生殖及胚胎学会（ESHRE）共识［7］诊断］45 例、多囊卵巢综合征（PCOS）组（依据2004 年鹿特丹标准［8］诊断）47 例、卵巢储备不足组（依据2011 年Bologna标准诊断［9］）42例。根据卵泡液25-（OH）D水平聚类分析分为2组，A组121例，B组71例。本研究通过我院伦理委员会的批准，征得研究对象同意，并签署知情同意书。

1.2 药物与仪器 重组人促卵泡刺激素注射液（商品名果纳芬，默克雪兰诺有限公司，进口药品注册证号S20160040，规格：450 IU）、醋酸加尼瑞克注射液［商品名晴乐，正大天晴药业集团股份有限公司，国药准字H20183025，规格：0.5 mL：0.25 mg（以加尼瑞克计）］、重组人绒毛膜促性腺激素（HCG）（商品名艾泽，默克雪兰诺有限公司，进口药品注册证号S20130091，规格：250 μg）；21 G 单腔取卵针（库克澳大利亚有限公司，国械注进20192181581，型号K-OPS-6035-RWHET）；25-（OH）D试剂盒（英国IDS公司）；JC028酶标仪（瑞士澳斯邦公司）。

1.3 卵巢刺激方案 卵巢刺激开始于月经周期第2天或第3天。根据患者体质量指数（BMI）、基础窦卵泡数、基础内分泌水平、抗苗勒管激素（AMH）给予皮下注射重组人促卵泡刺激素注射液（药物剂量150～225 IU/d）治疗，当第1 个卵泡直径达到12 mm 或雌二醇达到200 ng/L 时，开始给予皮下注射醋酸加尼瑞克注射液0.25 mg/d抑制垂体分泌促黄体生成素，当至少1 个卵泡直径达到18 mm 或2 个卵泡最大直径达到16 mm时，给予皮下注射HCG 250 μg。

1.4 卵泡液的收集 皮下注射HCG 36 h 后，阴道超声引导下，将21 G 单腔取卵针连接到-110 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）封闭真空系统，选择最大直径≥16 mm的卵泡进行取卵，将卵泡液放入无菌容器中，立即检查卵泡液中是否存在卵母细胞，当存在卵母细胞时，将卵母细胞置于培养皿中，将卵泡液（除外冲洗液和血液污染）3 000 r/min 离心10 min，取上清液置于到-80 ℃冰箱保存待测。

1.5 实验室检查 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法，按照试剂盒说明检测卵泡液25-（OH）D 水平。抽取研究对象清晨空腹静脉血2 mL，采用化学发光免疫分析法测定外周血激素水平，包括雌二醇、孕酮、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）。

1.6 卵泡数及卵泡直径的测量 由我科同一主治医师行阴道彩超测量卵泡数及卵泡直径。

1.7 胚胎评估 依照2011 年Istanbul 共识［10］中所述胚胎发育标准进行评估。培养第3天（D3）的优质胚胎即有8个对称的、非碎片的卵裂球。在培养的第5天（D5），在胚泡期考虑3个指标：内细胞团的发育、滋养外胚层的出现和囊胚腔的扩张。D5优质囊胚是指扩张囊胚，囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄（4级）及正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带中逸出（5 级），具有高质量的内细胞团（A 级：细胞数目多，排列紧密）和滋养外胚层（A 级：上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密）。

1.8 各指标计算 IVF正常受精率=D1出现2原核（PN）及2极体（PB）卵子数/IVF 加精卵子总数×100%；D3 优质胚胎形成率=D3 优质胚胎数/正常受精卵子数×100%；D5 优质囊胚形成率=D5 优质囊胚数/正常受精卵子数×100%；临床妊娠率=临床妊娠（胚胎移植后35 d行B超检查可见子宫内孕囊）周期数/胚胎移植总周期数×100%。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件包进行数据分析。计量资料以（±s）表示。应用K-均值聚类分析识别卵泡液25-（OH）D不同水平群体。2组间比较采用t检验；多组间的比较采用单因素方差分析。计数资料以例或例（%）表示，2组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同继发性不孕病因组一般资料及卵泡液25-（OH）D 的比较 4 组患者年龄、BMI、雌二醇、孕酮、LH、FSH及卵泡液25-（OH）D水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 K-均值聚类分析2 组一般资料以及卵泡液25-（OH）D 的比较 根据卵泡液25-（OH）D 水平进行K-均值聚类分析，B 组卵泡液25-（OH）D 水平显著高于A 组（P＜0.01）；B 组HCG 日（皮下注射HCG当日）大卵泡数及雌二醇、孕酮水平较A组显著升高（P＜0.01）；2 组患者年龄、BMI、促性腺激素（Gn）治疗量、HCG 日卵泡数、获卵数、LH、FSH，启动日（卵泡刺激第1天）雌二醇、孕酮、LH及FSH水平比较差异无统计学意义，见表2。

2.3 2 组胚胎评估及临床结局的比较 B 组IVF 正常受精率、D3优质胚胎形成率、D5优质囊胚形成率、临床妊娠率均显著高于A组（P＜0.05），见表3。

Tab.1 Comparison of general information and 25-(OH)D levels in follicular fluid between four groups of patients表1 不同病因组一般资料及卵泡液25-（OH）D水平的比较

Tab.2 Comparison of general information and 25-(OH)D levels in follicular fluid between two groups表2 2组研究对象一般资料及卵泡液25-（OH）D水平的比较

Tab.3 Comparison of embryo evaluation and clinical outcomes between two groups表3 2组研究对象胚胎评估及临床结局的比较

3 讨论

目前认为维生素D缺乏是一个全球性公共卫生问题［11］。人类80%～90%的维生素D 来源于日光照射皮肤合成，其余通过饮食获得。25-（OH）D经1α-羟化酶转化为活性形式1，25（OH）2D。1α-羟化酶及维生素D受体存在于卵巢、子宫、胚胎、睾丸、前列腺等组织中，因此可在生殖器官局部形成维生素D的活化形式并发挥作用。女性类固醇激素主要产生于卵巢颗粒细胞中，维生素D 通过其受体可以调节卵巢类固醇激素生成［12］。有研究证实维生素D有利于月经周期恢复和子宫内膜增殖［13-14］，促进卵泡发育［15］。

女性不孕病因包括盆腔因素如慢性输卵管炎症、输卵管积水或阻塞、输卵管异常、子宫内膜异位症、生殖器肿瘤、生殖道发育异常等，以及排卵障碍如PCOS、卵巢功能减退和早衰、持续性无排卵等。本研究入组患者病因包括：输卵管因素、PCOS、子宫内膜异位症、卵巢储备不足。多数学者仅对单一病因女性不孕症患者血清/卵泡液25-（OH）D 进行相关性研究，如输卵管因素［6］、PCOS［16］、子宫内膜异位症［17］、卵巢储备不足［18］患者与健康对照女性相比，血清25-（OH）D水平均较低。而关于女性不孕症不同病因组别之间血清/卵泡液25-（OH）D 比较的研究尚少见。本课题组在前期研究中证实卵泡液25-（OH）D水平与血清25-（OH）D水平高度相关，可反映体内25-（OH）D储存状态［19］。本研究已排除可能影响25-（OH）D水平的潜在混杂因素（如糖尿病、高血压、吸烟）［20］，结果显示在不同继发性不孕原因分组中，卵泡液25-（OH）D水平差异无统计学意义，因此在分析继发性不孕患者卵泡液25-（OH）D水平时，暂不考虑病因因素。本研究样本量较小，可扩大样本量进一步验证。

目前国内外尚无卵泡液维生素D正常水平的标准。本研究根据卵泡液25-（OH）D水平进行聚类分析，将研究对象分为卵泡液25-（OH）D 低水平和高水平2 组，2 组卵泡液25-（OH）D 水平有显著差异。2组患者年龄、BMI、Gn治疗量、HCG日卵泡数、获卵数差异无统计学意义，在HCG日，B组较A组外周血雌二醇、孕酮水平更高且有更多的大卵泡，提示在卵泡液25-（OH）D高水平组卵巢对药物刺激的反应较好。Kyrou 等［21］报道，在HCG 日大量的大卵泡与较高水平的雌二醇、孕酮相关。恒河猴动物实验证明卵泡液中1，25（OH）2D3以剂量和阶段依赖的方式影响卵泡的存活和生长以及卵母细胞的生长，低剂量组1，25（OH）2D3促进窦前卵泡存活，高剂量组卵泡直径增大［22］，与本研究的结果相似。在人类颗粒细胞模型中，卵泡液中25（OH）D不足（＜75 nmol/L）的小卵泡（＜14 mm）与卵泡液中25（OH）D 水平≥75 nmol/L 的小卵泡相比，前者AMH 受体-ⅡmRNA 水平是后者2 倍［23］。而AMH 可降低卵泡对FSH 的敏感性及卵巢颗粒细胞芳香化酶的活性，阻碍卵泡发育［24］。推测维生素D通过可抑制AMH受体-Ⅱ的表达，降低AMH 对卵巢颗粒细胞的作用，从而促进卵泡成熟［25］。

本研究结果显示，B组IVF正常受精率、D3优质胚胎形成率、D5优质囊胚形成率、临床妊娠率高于A组，提示卵泡液25-（OH）D 可能有助于行IVF 治疗的继发性不孕女性卵母细胞成功受精、胚胎发育及临床妊娠，可能与以下机制有关：（1）维生素D 通过AMH调节卵泡/卵母细胞成熟。人AMH基因启动子区域存在功能性维生素D反应元件（VDRE），维生素D可直接影响AMH的表达［11］。AMH结合AMHR-Ⅱ受体，通过Smad1/5/8 信号通路调节卵泡/卵母细胞成熟［26］。（2）维生素D通过调节子宫内膜容受性而影响临床妊娠率［27］。维生素D可与子宫内膜间质细胞中同源异型盒蛋白（homeobox protein A10，HOXA10）的受体结合，上调HOXA10 基因表达。在胚胎植入期HOXA10基因高表达是子宫内膜容受性良好的关键标志，同时HOXA10 是胚胎植入的必需基因，对女性生育力和胚胎着床至关重要。（3）维生素D 可通过参与免疫调节功能影响胚胎着床及早孕［28］。维生素D 通过抑制Th1 细胞增殖和促进Th2细胞来调节辅助性T淋巴细胞群［29］，Th1细胞分泌白细胞介素（IL）-2 和肿瘤坏死因子-α 等细胞因子促进细胞免疫，Th2 细胞可分泌IL-6、IL-10 等细胞因子促进体液免疫，在正常妊娠母体中，细胞免疫受抑制，体液免疫增强，Th2细胞处于优势地位有利于母体免疫耐受［30-31］。

由于本研究是单中心研究，且样本量较小；加之目前无卵泡液25-（OH）D 正常值标准，本研究分组标准是根据纳入数据界定，因此也仅适合本研究。

综上所述，不同病因的继发性不孕女性卵泡液25-（OH）D水平无显著差异；在继发性不孕行IVF治疗的女性中，卵泡液25-（OH）D 高水平更易产生大卵泡及优质胚胎，其临床妊娠率也更高。