LncRNA-MALAT1通过miR-142-3p/TEAD1分子轴调控结直肠癌细胞增殖与凋亡

2020-12-18张智成杨清泉

天津医药 2020年12期

张智成，杨清泉

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大最常见的恶性肿瘤［1］。每年全球约有90 万人死于CRC［2］。在我国，由于生活方式和饮食习惯的改变，CRC 已成为迅速增加的恶性肿瘤之一［3］。目前，尽管通过外科手术结合辅助化疗、靶向药物等手段提高了CRC 患者生存率，但控制肿瘤局部复发和转移仍是难题。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一类新型的非编码RNA，长度超过200个核苷酸，在基因表达调控中起着至关重要的作用［4］。作为LncRNA 家族成员之一，LncRNA-肺腺癌转移相关转录子1（MALAT1）在结直肠癌、食管癌等多种胃肠道肿瘤组织和细胞中高表达，具有重要的调控作用。LncRNA 分子内富含微小RNA（miRNA）结合位点，可以作为竞争性内源性RNA（ceRNA），在细胞中起到分子海绵的作用，介导肿瘤进展，使得LncRNA-miRNA-mRNA 调控网络有望成为CRC 诊断与治疗的分子靶点［5］。本研究通过检测人正常结肠上皮细胞与CRC 细胞株中LncRNA-MALAT1、miR-142-3p 与TEA 结构域转录因子1（TEA domain transcription factor 1，TEAD1）的表达水平，探讨LncRNA-MALAT1能否通过与miR-142-4p结合，进而影响其潜在靶基因TEAD1蛋白水平的表达，调控CRC细胞的增殖与凋亡，影响CRC的病理进程。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器结直肠癌细胞株HCT116 细胞、SW480 细胞、DLD-1 细胞、Caco-2 细胞以及McCoy′s 5A 培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，人正常结肠上皮细胞FHC细胞购自上海青旗生物技术发展有限公司，RPMI-1640培养基、MEM 培养基与DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司，荧光素酶检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，Bax 兔多克隆抗体、Bcl-2 兔多克隆抗体、β-actin 兔多克隆抗体、HRP 标记山羊抗兔IgG 购自沈阳万类生物科技有限公司，CyclinD1兔单克隆抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，TEAD1兔多克隆抗体购自中国Affinity Biosciences 公司，TRIpure 购自北京百泰克生物技术有限公司，SYBR Green I 购自北京索莱宝科技有限公司，

si-MALAT1 及阴性对照si-NC 片段、miR-142-3p mimic 及阴性对照NC mimic 片段、miR-142-3p inhibitor 及阴性对照NC inhibitor 片段购自武汉金拓思生物科技有限公司，MALAT1-wtUTR、 MALAT1-mutUTR、 TEAD1-wtUTR 与 TEAD1-mutUTR载体购自南京金斯瑞生物科技有限公司。荧光定量PCR 仪购自韩国BIONEER 公司，多功能酶标仪购自瑞士TECAN 公司，流式细胞仪购自美国艾森生物公司，倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS 公司，电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 HCT116 细胞使用含10% 胎牛血清的McCoy′s 5A培养基，SW480细胞与DLD-1细胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，Caco-2 细胞使用含10%胎牛血清的MEM 培养基，FHC 细胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，所有细胞均置于37 ℃、5% CO2条件下常规培养。

1.3 细胞转染与实验分组选取对数生长期结直肠癌细胞株HCT116 细胞、SW480 细胞、DLD-1 细胞与Caco-2 细胞以及人正常结肠上皮细胞FHC细胞，设置为HCT116组、SW480组、DLD-1组、FHC 组与Caco-2组；选取对数生长期HCT116细胞，分别使用si-NC 片段、si-MALAT1片段、si-MALAT1片段+NC inhibitor 或si-MALAT1 片段+miR-142-3p inhibitor 共转染HCT116 细胞，另设置不进行转染仅进行常规培养的HCT116 细胞组别，即si-NC 组、si-MALAT1 组、si-MALAT1+NC inhibitor 组、si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor 组与Control组。

1.4 Real-time PCR 检测LncRNA-MALAT1与miR-142-3p基因的表达通过TRIpure提取各组细胞总RNA，将1 μg RNA加入至20 μL 混合反应体系中反转录至cDNA，采用ExicyclerTM96 荧光定量PCR 仪进行Real-time PCR 检测与分析。引物序列见表1。PCR 反应体系20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，ddH2O 8 μL。LncRNA-MALAT1基因检测反应条件：94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环；miR-142-3p基因检测反应条件：94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40 个循环。miR-142-3p基因检测以U6基因作为内参，LncRNA-MALAT1基因检测以β-actin基因作为内参，采用2-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平。

1.5 Western blot检测TEAD1、Bax、Bcl-2与Cyclin D1蛋白的表达提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取40 μg蛋白上样，采用12%或15%分离胶，5%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗TEAD1 抗体（1∶1 000）、Bax 抗体（1∶500）、Bcl-2 抗体（1∶500）、Cyclin D1抗体（1∶1 000）和β-actin抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤后加入二抗羊抗兔IgG-HRP（1∶5 000），37 ℃孵育45 min，ECL 法检测。用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer 软件）分析目标条带的光密度（OD）值。

Tab.1 Real-time PCR primer sequences表1 Real-time PCR引物序列

1.6 CCK-8实验检测细胞增殖选取对数生长期结直肠癌细胞株HCT116细胞，以3×103个/孔密度接种至96孔板，待细胞贴壁后，按1.3分组转染各组细胞，各转染组细胞转染处理0、24、48、72 h 后，上述HCT116 细胞每孔更换为100 μL 培养基和10 μL CCK-8 试剂，继续培养2 h，使用酶标仪测定450 nm波长下的OD值。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡选取对数生长期HCT116细胞，以4×105个/孔密度接种至6 孔板，待细胞贴壁后，各转染组设置同1.3 组。各转染组细胞转染处理48 h 后，同步收集上述各组细胞，加入195 μL Annexin V-FITC 结合液，轻轻重悬细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL Propidium Iodide，混匀后室温避光孵育10～20 min，流式细胞仪分析凋亡率。

1.8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-3p 与TEAD1的结合选取对数生长期HCT116细胞，待细胞贴壁后，分别使用1.5 μg MALAT1-wtUTR 质粒（野生型）、1.5 μg MALAT1-mutUTR 质粒（突变型）与25 pmol NC mimic 或25 pmol miR-142-3p mimic 片段共转染HCT116 细胞，即MALAT1-wtUTR+NC mimic 组、MALAT1-mutUTR+NC mimic组、MALAT1-wtUTR+miR-142-3p mimic 组与MALAT1-mutUTR+miR-142-3p mimic 组；分别使用TEAD1-wtUTR 质粒（野生型）或TEAD1-mutUTR 质粒（突变型）与NC mimic 或miR-142-3p mimic 片段共转染HCT116 细胞，即TEAD1-wtUTR+NC mimic 组、TEAD1-mutUTR+NC mimic 组、TEAD1-wtUTR+miR-142-3p mimic 组与TEAD1-mutUTR+miR-142-3p mimic组。上述各组细胞转染48 h后，使用荧光素酶活性检测试剂盒，根据其说明检测细胞相对荧光素酶活性。

1.9 统计学方法使用Graphpad prism 8.0进行实验数据的统计与分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，所有实验重复3 次。多组间比较采用单因素方差分析，并通过Tukey法进行校正；组间多重比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人正常结肠上皮细胞与结直肠癌细胞中LncRNA-MALAT1、miR-142-3p基因与TEAD1 蛋白的表达变化与人正常结肠上皮细胞FHC 细胞相比，结直肠癌细胞株（SW480、DLD-1、HCT116 与Caco-2 细胞）中LncRNA-MALAT1基因、TEAD1 蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05），miR-142-3p基因相对表达量显著降低（P＜0.05）。结直肠癌细胞株中HCT116 细胞LncRNA-MALAT1表达量相对较高，故用于后续实验检测。见图1、表2。

Fig.1 The expression of TEAD1 in human normal colon epithelial cells and colorectal cancer cell lines图1 人正常结肠上皮细胞与结直肠癌细胞TEAD1表达

Tab.2 The expression levels of LncRNA-MALAT1,miR-142-3p and TEAD1 in human normal colon epithelial cells and colorectal cancer cell lines表2 人正常结肠上皮细胞与结直肠癌细胞LncRNAMALAT1、miR-142-3p基因与TEAD1蛋白表达水平（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与FHC组比较，P＜0.05

组别FHC组SW480组DLD-1组HCT116组Caco-2组F LncRNA-MALAT1 1.00±0.03 2.61±0.25a 1.72±0.05a 3.56±0.29a 2.65±0.24a 71.150＊＊miR-142-3p 1.00±0.04 0.30±0.02a 0.56±0.04a 0.25±0.02a 0.40±0.03a 277.700＊＊TEAD1 1.00±0.09 4.10±0.33a 2.05±0.21a 5.06±0.36a 4.33±0.32a 110.900＊＊

2.2LncRNA-MALAT1对TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2与Bax 蛋白表达的影响与si-NC 组细胞相比，si-MALAT1 组细胞Bax 蛋白的相对表达量显著升高，TEAD1 蛋白、Bcl-2 蛋白与Cyclin D1 蛋白的相对表达量显著下降（P＜0.05），见图2、表3。

2.3LncRNA-MALAT1通过miR-142-3p调控下游蛋白以及细胞增殖与凋亡 Control 组、si-NC 组、si-MALAT1 组、si-MALAT1+NC inhibitor 组、si-MALAT1+miR-142- 3p inhibitor 组凋亡率分别为（4.15±0.05）% 、（4.29±0.06）% 、（15.38±0.29）% 、（14.22±0.72）% 和（5.85±0.43）%（n=3，F=582.400，P＜0.01）。与si-NC 组细胞相比，si-MALAT1 组细胞miR-142-3p基因、Bax 蛋白相对表达量与细胞凋亡率显著上升（P＜0.05），LncRNA-MALAT1基因、TEAD1 蛋白、Bcl-2 蛋白、Cyclin D1 蛋白相对表达量，48、72 h细胞增殖水平显著下降（P＜0.05）；与si-MALAT1+NC inhibitor 组细胞相比，si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor 组细胞miR-142-3p基因、Bax蛋白相对表达量与细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），LncRNA-MALAT1基因、TEAD1 蛋白、Bcl-2 蛋白、Cyclin D1蛋白相对表达量，48、72 h细胞增殖水平显著升高（P＜0.05）。见图3、4，表4、5。

2.4 LncRNA-MALAT1 与miR-142-3p 以及TEAD1与miR-142-3p 靶向结合验证 MALAT1-wtUTR+NC mimic 组、MALAT1-mutUTR+NC mimic 组、MALAT1-wtUTR+miR-142 -3p mimic 组、MALAT1-mutUTR+miR-142 -3p mimic 组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.10、1.07±0.12、0.57±0.06和0.97±0.12，与MALAT1-wtUTR+NC mimic 组细胞相比，MALAT1-wtUTR+miR-142-3p mimic 组细胞相对荧光素酶活性显著下降（n=3，F=14.550，P＜0.01）；TEAD1-wtUTR+NC mimic 组、TEAD1-mutUTR+NC mimic 组、TEAD1-wtUTR+miR-142 -3p mimic 组和TEAD1-mutUTR+miR-142-3p mimic 组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.11、0.95±0.14、0.55±0.06 和0.99±0.10，与TEAD1-wtUTR+NC mimic 组细胞相比，TEAD1-wtUTR+miR-142-3p mimic 组细胞相对荧光素酶活性显著下降（n=3，F=12.070，P＜0.01）。

Fig.2 The expressions of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in three groups of HCT116 cells图2 各组HCT116细胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2与Bax表达

Tab.3 The expression levels of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in three groups of HCT116 cells表3 各组HCT116细胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2与Bax表达水平（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与si-NC组比较，P＜0.05

组别Control组si-NC组si-MALAT1组F TEAD1 1.00±0.08 1.01±0.04 0.40±0.05a 116.400＊＊Cyclin D1 1.00±0.00 0.98±0.03 0.56±0.00a 871.000＊＊Bcl-2 1.00±0.02 0.99±0.02 0.39±0.01a 1 506.000＊＊Bax 1.00±0.04 0.94±0.05 3.38±0.08a 1 805.000＊＊

Fig.3 The expressions of TEAD1,Cyclin D1,Bcl-2 and Bax in four groups of HCT116 cells图3 各组HCT116细胞TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2与Bax表达

3 讨论

LncRNA 是长度大于200 个核苷酸（nt）且不具有编码蛋白质功能的RNA分子［6］。作为LncRNA家族成员，LncRNA-MALAT1 首先被发现于早期非小细胞肺癌，与肿瘤转移显著相关［6］。研究发现，LncRNA-MALAT1 在多种肿瘤中高表达，能够作为肿瘤标志物，促进肿瘤的发生与发展。相关研究报道，在口腔鳞状细胞癌中，LncRNA-MALAT1能够通过竞争性结合miR-143-3p，促进miR-143-3p 靶基因黑色素瘤抗原家族成员A9（melanoma antigen family member A9，MAGEA9）的表达，促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖与迁移［7］。在卵巢癌中，LncRNA-MALAT1 能够通过活化Wnt/β-catenin 信号通路，提升卵巢癌细胞的生存与转移能力，促进卵巢癌的发生与发展［8］。有研究报道，LncRNAMALAT1 在CRC 组织中呈高表达，且对CRC 细胞具有重要的调控作用，促进CRC 的病理进程［9］。本研究显示，LncRNA-MALAT1能够促进CRC细胞增殖，并抑制CRC细胞凋亡，起到提升CRC细胞生存能力的调控作用，促进CRC 的发生与发展，这与LncRNA-MALAT1在肿瘤中调控作用的相关研究结果一致。

Fig.4 Comparison of apoptosis rates between four groups of HCT116 cells图4 各组HCT116细胞凋亡率比较

Tab.4 The expression levels of LncRNA-MALAT1 and miR-142-3p in four groups of HCT116 cells表4 各组HCT116 细胞LncRNA-MALAT1、miR-142-3p、TEAD1、Cyclin D1、Bcl-2与Bax表达水平（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与si-NC 组比较，b与si-MALAT1+NC inhibitor 组比较，P＜0.05

组别si-NC组si-MALAT1组si-MALAT1+NC inhibitor组si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor组F LncRNAMALAT1 1.08±0.03 0.21±0.02a 0.20±0.02 0.82±0.07b miR-142-3p 1.01±0.08 4.35±0.14a 4.24±0.13a 1.18±0.04b TEAD1蛋白1.00±0.07 0.52±0.04a 0.51±0.06 0.74±0.06b 399.500＊＊1 034.000＊＊47.560＊＊组别si-NC组si-MALAT1组si-MALAT1+NC inhibitor组si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor组F Cyclin D1蛋白1.00±0.01 0.50±0.01a 0.52±0.01 0.79±0.03b Bcl-2蛋白1.00±0.02 0.39±0.01a 0.38±0.06 0.73±0.05b Bax蛋白1.00±0.05 3.57±0.12a 3.56±0.05 1.94±0.06b 801.700＊＊161.800＊＊908.800＊＊

Tab.5 Comparison of proliferation ability between four groups of HCT116 cells表5 各组HCT116细胞增殖能力比较（n=3，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a与si-NC 组比较，b与si-MALAT1+NC inhibitor 组比较，P＜0.05

组别Contol组si-NC组si-MALAT1组si-MALAT1+NC inhibitor组si-MALAT1+miR-142-3p inhibitor组F 0 h 0.23±0.03 0.26±0.04 0.26±0.04 0.24±0.03 24 h 0.49±0.08 0.45±0.05 0.40±0.04 0.41±0.05 48 h 0.77±0.08 0.81±0.07 0.60±0.07a 0.55±0.07 72 h 1.01±0.12 1.09±0.13 0.73±0.10a 0.68±0.08 0.26±0.03 0.48±0.06 0.73±0.10b 0.98±0.12b 0.562 2.719 10.040＊＊14.420＊＊

LncRNA 可作为miRNA 的分子海绵，通过吸附miRNA，削弱miRNA 对mRNA 的靶向调控作用［10］。miRNA是一类小的单链非编码RNA，能够在转录后水平调节多种原癌基因与抑癌基因的表达［11］。研究显示，作为miRNA 家族中的一员，miR-142-3p 在肿瘤疾病中能够发挥重要的调控作用。在胃癌中，miR-142-3p 能够靶向抑制细胞周期蛋白T2（CCNT2）的表达，抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭，抑制胃癌的病理进程［12］；在乳腺癌中，miR-142-3p 能够被LncRNA-NNTAS1 吸附，导致E 盒结合锌指蛋白1（ZEB1）表达升高，进而提升乳腺癌细胞的生存与转移能力，促进乳腺癌的发生与发展［13］；而在CRC 中，miR-142-3p 的下调提示CRC 的发生，且miR-142-3p可以作为肿瘤抑制因子，对抑制CRC发生与发展起到重要调控作用［14-15］。本研究显示，LncRNA-MALAT1 能够结合miR-142-3p，可以作为miR-142-3p 的分子海绵，通过吸附miR-142-3p，促进CRC 细胞增殖，并抑制CRC 细胞凋亡，调控CRC的病理进程，与既往研究结果相吻合。

miRNA 能够通过与靶mRNA 的3′非编码区（3′UTR）互补结合，在不影响靶mRNA 稳定性的情况下，阻遏靶mRNA的翻译进程，进而参与调控肿瘤的病理进程［11］。本研究结果显示，miR-142-3p 与TEAD1 存在靶向关系。TEAD1 是一种重要的转录增强因子，隶属于TEF 蛋白家族，可以与yes 相关蛋白（YAP）形成蛋白质复合物，并通过参与到Hippo信号通路，对细胞的生存能力具有重要的调控作用［16］。研究发现，在多种肿瘤中，TEAD1 均能够发挥重要的调控作用；在胶质母细胞瘤中，TEAD1呈高表达，能够作为原癌基因，促进胶质母细胞瘤的发生与发展［17］。在骨肉瘤中，抑制TEAD1表达能够抑制骨肉瘤细胞的生存能力与转移能力［18］。而在CRC 中，TEAD1 表达的升高能够引起CRC 细胞增殖水平的升高［19］。本研究显示，作为miR-142-3p的靶基因，当LncRNA-MALAT1吸附miR-142-3p后，TEAD1 表达水平显著升高，能够促进CRC 细胞增殖，抑制CRC细胞凋亡。

Cyclin D1 是一种细胞周期蛋白，能够与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）4或CDK6在G1期结合形成复合物，再通过N末端LECXF 基序与成视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）结合，使pRb的丝氨酸和酪氨酸残基磷酸化，释放出转录因子E2F，驱动细胞由G1 期进入S 期，促进细胞增殖，而当Cyclin D1 表达失控时，将引起细胞增殖周期失调，导致肿瘤发生［20］。Bcl-2 原癌基因与细胞凋亡密切相关。有研究显示Bcl-2可能通过抗氧化作用阻断Ca2+从内质网释放，影响线粒体释放细胞色素C 发挥抗凋亡的作用［21］。Bax 基因是Bcl-2 基因族内的同源基因，其编码的Bax 蛋白与Bcl-2 蛋白具有21%的同源性，然而Bax对细胞凋亡的调控作用与Bcl-2 截然相反。Bax 可能通过破坏线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和腺苷三磷酸合成功能改变细胞氧化还原作用，激活凋亡信号caspase 信号转导途径，促进细胞凋亡进程［21］。Cyclin D1 与Bcl-2 蛋白表达的升高以及Bax 蛋白表达的降低能够促进CRC 的发生与发展，而抑制Cyclin D1 与Bcl-2 蛋白表达或促进Bax 蛋白的表达能够促进CRC 细胞凋亡，抑制CRC 细胞增殖，对CRC的病理进程起到一定的缓解作用［22］。本实验结果显示，抑制LncRNA-MALAT1基因表达能够抑制Cyclin D1 与Bcl-2 蛋白表达，促进Bax 蛋白的表达；而在此基础上进一步抑制miR-142-3p的表达，能够部分逆转抑制LncRNA-MALAT1基因表达所引起的Cyclin D1、Bcl-2 与Bax 蛋白表达的变化，表明LncRNA-MALAT1能够通过miR-142-3p调控Cyclin D1、Bcl-2 与Bax 蛋白的表达，进而影响CRC 细胞的增殖与凋亡，对CRC起到一定的调节作用。

综上所述，LncRNA-MALAT1能够通过与miR-142-3p结合，促进miR-142-3p靶基因TEAD1 的表达，促进CRC 细胞增殖，抑制凋亡。本研究阐明了LncRNA-MALAT1/ miR-142-3p/TEAD1 分子轴在CRC 中的作用与调控机制，为LncRNA-MALT1 在CRC等肿瘤疾病中的作用与机制研究提供了理论基础。LncRNA-MALAT1/miR-142-3p/TEAD1 分子轴有望成为CRC 早期诊断和预后评估的分子标志物，针对LncRNA-MALAT1/miR-142-3p/TEAD1 分子轴的靶向治疗亦可能成为缓解CRC 等肿瘤的新手段。