“减抗”、“替抗”背景下抗菌肽的应用和研究进展

邓赣奇，黄增颖，梁耀文，张辉华，林树茂，刘 燊

(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528000)

抗生素自从被发现以来，拯救了亿万动物和人的生命，因此也被称为20世纪以来最伟大的发现之一。将抗生素应用到饲料行业中，也极大地推动了畜牧业的发展。但随着抗生素的广泛应用以及高剂量的使用，其在畜禽体内大量残留，不仅威胁到动物食品安全和影响生态环境，更使许多细菌产生耐药性，进而产生“超级细菌”。近年来，也有研究发现抗生素对有益菌有抑制作用，造成动物体内的菌群紊乱，降低动物机体对各种营养物质的吸收利用率，从而造成其腹泻甚至死亡[1-3]。在欧洲的一些国家，抗生素被禁止添加到饲料中，因此寻找一种新型抗菌剂替代抗生素已成为急待解决的问题。目前人们发现了一些新型的抑菌剂如噬菌体制剂、酶制剂、植物提取物、中草药制剂和抗菌肽等。抗菌肽是现在研究中比较热门的方向，也是最具有应用与研究前景的一个领域。

20世纪70年代，瑞典科学家Boman发现第一种抗菌肽——天蚕素抗菌肽，随着人们对抗菌肽的深入研究，相继从昆虫、哺乳动物、植物中发现了3 000多种。抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是生物机体抵抗病原菌产生的一种防御性小肽，存在于各种动植物及微生物中，是组成免疫系统的重要成分[4]。有研究表明，抗菌肽对真菌、病毒、肿瘤等都有抑制作用，如艾滋病毒、疱疹病毒[5]、膀胱癌、肝癌、宫颈癌等[6-8]。因其抗菌谱广、分子量小、不易产生耐药性、热稳定性和水溶性好，是目前替代抗生素较为理想的抗菌剂之一。

1 抗菌肽的结构特点

抗菌肽由20～60个氨基酸组成，其N端富含亲水性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等，有利于抗菌肽吸附到细胞膜上；其C端富含疏水性氨基酸，有利于其酰胺化。抗菌肽二级结构的多样性为其功能多样性奠定了基础，根据氨基酸的位置、大小和构象，AMPs的二级结构可分为4种：(1)具有α-螺旋结构的肽，如人的阴极诱导素。拥有此种结构的肽其长度一般较短，有比较多的精氨酸和赖氨酸，且此类肽具有两亲性，其一端为亲水区，对应端则为疏水区，这种水脂两亲结构是抗菌肽杀菌功能的基础；(2)具有β-折叠结构的肽，如鲎肽，这类肽主要包括人及其他哺乳动物的防御素、植物及昆虫防御素等，其拥有的二硫键能够稳固肽结构，在穿入细胞膜时仍能够维持这种结构，充分发挥其杀菌功能；(3)具有片层结构的肽，如牛吲哚啶，此类肽多呈线性结构，不具有半胱氨酸，富含脯氨酸、色氨酸和精氨酸；(4)具有环状结构的肽，如在恒河猴中发现的环防御素，此类肽的环形结构靠一个单键维持，而且具有α-螺旋结构、β-片状结构，拥有较强的抗菌活性。

抗菌肽的多结构特性，使其除具有抑制微生物活性，免疫调节剂、抗肿瘤药物等，它还可作为信号分子、避孕剂、有丝分裂剂等[9]。

2 抗菌肽的生理功能及其作用机制

2.1 抗细菌

抗菌肽具有广谱的抗菌性，它对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都有抑制能力，但某些抗菌肽只对一些特定的细菌有抑制效果[10]。魏晓晓等[11]研究表明，抗菌肽JH-3对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌、猪霍乱沙门菌 、副猪嗜血杆菌等均具有良好的抗菌活性。不同的抗菌肽其抑制能力相差比较大，根据刘倚帆等[12]的研究，不同抗菌肽之间或抗菌肽与抗生素之间还能够发生协同作用，并产生较强的抗菌作用。抗菌肽的抗菌机制主要分为细胞膜损伤机理和胞内损伤机理。但根据汪以真等[13]的最新研究表明，有些抗菌肽还能够形成网状结构包裹细菌，减少细菌粘附到肠道黏膜的损伤而达到保护机体的目的。

2.1.1 细胞膜损伤机理 绝大多数抗菌肽的作用机理都是细胞膜损伤机制，其最重要的是靠静电的吸引，使氨基酸残基与磷脂酸分子结合。抗菌肽的疏水端则插入到细胞质膜中，使膜的结构发生改变或将膜蛋白凝集而失去活性，抗菌肽进入磷脂双分子层后，其亲水端发生结合并形成膜孔道，细胞内的物质外泄，细菌不能维持正常的渗透压而死亡。目前细胞膜损伤机理比较盛行的模型主要有4种[14]：桶板模型、地毯模型、环孔模型和凝集模型。

在桶孔模型中，抗菌肽单体聚集在膜表面，当这些单体形成多肽则插入细胞膜，它们的非极性侧链直接作用于膜的疏水脂核，多肽的亲水表面向内并形成跨膜孔，导致细胞内含物的释放和细胞的死亡。如Alamethicin、Gramicidin S等[15]。

在地毯模型中，抗菌肽最初被结合在膜的表面，形成局部的“地毯”。当抗菌肽覆盖在磷脂双分子层表面并达到特定的阈值浓度时，磷脂双分子层内外受力不均而变形，细胞膜破裂而达到抑菌目的，其中杀灭革兰氏阴性菌和寄生虫的机制多属于此类。此类抗菌肽有 Caerin Trichogin LL-37[16]。

在环孔模型中，聚集的多肽无论是在与膜表面结合之前还是之后，都会诱导膜去极化，形成环状的跨膜孔，细胞的跨膜电位或者渗透功能遭到破坏，菌体则裂解死亡。如Sticholysin、Mellitin、Maganin等[17]。

在凝集模型中，抗菌肽与脂多糖形成竞争并取代二价金属离子，扰乱细胞膜大分子的组装，进而可以同时接触磷脂双分子层的内外层，形成特殊的脂肽区域并在细胞膜表面形成离子泄露通道。此类抗菌肽有Gramicidins、Polyphemusin等[18]。

2.1.2 胞内损伤机理 细胞膜的损伤机理并不是抗菌肽的唯一作用机制，有研究者发现少数抗菌肽可以在不破坏细胞膜的情况下，穿过细胞膜并抑制菌体细胞生物大分子的表达，包括抑制DNA、RNA和蛋白质的合成、抑制胞内酶的活力、抑制细胞呼吸作用和细胞壁的形成等过程[19]，这类抗菌肽都含有丰富的精氨酸和脯氨酸，如Pleurocidin、Dermaseptin、Indolicidin、PR-39等。

2.2 抗真菌

目前研究发现的抗真菌肽有天蚕素、线肽素、贻贝素、果蝇抗菌肽等[20]。抗菌肽抑制真菌的主要机制有以下几个方面：(1)抗菌肽可以阻止、破坏真菌细胞壁的形成过程，如棘球白素可以抑制1，3-β-葡聚糖的合成酶，进一步抑制葡聚糖的合成而使真菌停止生长[21]；(2)抗菌肽与细胞膜结合并在细胞膜上形成孔洞，使细胞内容物外泄而达到杀菌[22]；(3)抗菌肽与真菌细胞内的各种生物大分子细胞器相互作用而致使真菌死亡，如Histatin5可以在不破坏细胞膜的情况下进入到真菌中，与线粒体结合并相互作用，从而能够抑制细胞的呼吸作用，破坏线粒体和质膜，核苷酸类物质外流，导致真菌死亡[23]。

2.3 抗病毒

研究发现，很多种抗菌肽都展现出一定的抗病毒活性，如张守平等[24]报道，人类呼吸道粘液里含有的防御素类和抗菌肽类都可在一定程度上抑制流感病毒，而且对DNA、RNA病毒都具有抑制作用，对带有膜结构的病毒抑制作用更加明显。目前，已经被证明的抗病毒机制主要有3种[25-26]：(1)有的抗菌肽通过直接与病毒的膜接触相互作用而达到抑菌效果，如α-防御素(humanα-defensin,HNP)通过与接触疱疹病毒的膜而产生作用；(2)有的抗菌肽能够直接抑制病毒的增殖，如Wachinger等[27]发现，天蚕素能有效抑制HIV病毒的繁殖；(3)有的抗菌肽能够扰乱病毒分子组装而达到杀菌作用，如蜂毒素与烟草花叶病毒的部分氨基酸存在相似性，蜂毒素则可以干扰烟草花叶病毒组装的过程。

2.4 抗肿瘤

抗菌肽作为免疫防御系统的重要组成部分，具有抗肿瘤活性，其可以选择性地杀伤癌细胞，对其他正常细胞的损伤小，对研发新型抗肿瘤药物具有极大的意义。目前已发现近100种抗菌肽具有抗肿瘤活性，如表皮素B2(dermaseptin，DRS)是从亚马逊树蛙的皮肤分泌物中鉴定出来的一种抗菌肽，其在体内对前列腺癌细胞株PC3具有抗肿瘤和血管抑制作用。而人工合成的某些抗菌肽同样展现出较强的抗肿瘤活性，如Epinecidin-8和Pardaxin-6，对人上皮癌(HeLa)和纤维肉瘤(ht-1080)细胞具有较高的抗肿瘤活性。部分抗菌肽主要是通过溶解肿瘤细胞膜而起到抗肿瘤活性，如蛙皮素；有的抗菌肽能够破坏肿瘤细胞的内部结构，如天蚕素B3能够破坏肿瘤细胞的微管，肿瘤细胞的完整性破坏，则其发生裂解死亡；有的抗菌肽能够增强机体自身的免疫功能而增强抗肿瘤活性；有的抗菌肽能够破坏肿瘤细胞的骨架及核骨架，并诱导肿瘤凋亡[28]。AMPs的抗肿瘤功能使其生物学活性成为研究的热点。

2.5 免疫调节

抗菌肽作为先天性免疫系统的一部分，广泛存在于动植物，在高等脊椎动物中，这部分抗菌肽也称为宿主防御肽(Host defensing peptides,HDPs)，其可以介导免疫系统的调节作用。天然产生的防御肽有两个主要家族：Defensins 和 Cathelicidins。根据二硫键和半胱氨酸残基位置的不同，防御素被进一步细分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3个亚家族[29]。从直接杀死入侵的病原体到调节宿主的免疫和其他生物反应，它们都表现出广泛的生物学活性。抗菌肽免疫调节的主要机制是其作为先天性免疫和获得性免疫的趋化剂，激活相应的免疫细胞并促进其增殖，如人阴极诱导素LL-37可通过甲酰肽受体样和一个独特的GI偶联受体吸引中性粒细胞、单核细胞、Tcells和肥大细胞；另外防御肽还能激发白细胞和上皮细胞的其他复杂反应，改变基因的表达和行为，以促进和调节免疫反应，如当使用LL-37刺激人单核细胞和巨噬细胞原代细胞时，趋化因子、趋化因子受体和其他与细胞粘附、通讯和运动有关的基因会产生诱导作用;抗菌肽也可以作为炎症的调节因子来调节炎症水平而起到免疫保护作用，如LL-37可抑制脂多糖引起的炎性细胞因子的分泌，对实验性内毒素血症有一定的保护作用[30]。

3 抗菌肽的基因工程表达

目前人们获取抗菌肽的方式主要有从各种生物中提取、人工化学合成和构建基因菌株表达获得3种。然而从生物中提取天然抗菌肽所得的含量少，完全不能满足日常的使用，且整个提取过程较复杂，不易操作。人工合成的抗菌肽与天然抗菌肽的结构存在差异并导致其生理活性存在差异，成本也较高，要实现产业化生产存在一定的难度。目前人们获取抗菌肽的方式主要是通过大肠杆菌、酵母菌、杆状病毒、枯草芽孢杆菌等基因工程菌来表达多肽，此种方法效率高、成本低、而且易操作。

3.1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌是最早成功表达抗菌肽的系统，因其结构简单，已经成为最流行的表达平台。用大肠杆菌表达外源蛋白主要是其高细胞密度培养比较容易实现、繁殖快、易于培养、操作简单、转化率高、成本低。目前大肠杆菌的表达载体主要有融合型、非融合型和外分泌型表达。但该表达系统也存在一些不足之处[31]，其一，因大肠杆菌是原核生物，所以其表达的蛋白不具有真核生物翻译出来蛋白质的功能；其二，没有像真核生物修饰蛋白的功能，难以表达出复杂的蛋白质，当外源基因在大肠杆菌中表达时往往以不溶性颗粒的形式形成密集的变性卵磷脂分子，称为包涵体[32]，包涵体蛋白缺乏生物活性，需要一个复杂的修饰过程，包括溶质化、折叠和纯化，才能部分恢复功能活性产品[33]；其三，大肠杆菌表达出来的抗菌肽会抑制原大肠杆菌表达载体，影响下一步的表达[34]。

3.2 酵母表达系统

因为原核生物表达系统的缺点，很多研究者就开始研究真核生物的表达系统，他们选择酵母作为试验对象，并与大肠杆菌相比较，发现这种系统操作简单、不会产生毒性、利于纯化、比较适于工业化的生产。随着研究的深入及对该系统的完善了解，该系统在现今也是较为常用的表达体系之一。目前，该表达系统在毕赤酵母中应用比较多，而且也达到了比较成熟的阶段。但应用此种表达系统在分批栽培后期需要大量投资，不是非常经济[35]。

3.3 枯草芽孢杆菌表达系统

枯草芽孢杆菌表达系统不存在上述两种表达系统的缺点，可作为高效的表达载体，特别是用于分泌外源蛋白[36]。分泌的外源蛋白通常以生物活性的形式存在，下游纯化大大简化[37-38]。此外，它还具有其他优点，如枯草芽孢杆菌为非致病菌，安全无毒，分泌能力强且分泌机制、生理生化性质较为清晰，理论上产量较高，产品不聚合，可持续种植和生产[39]。枯草芽孢杆菌表达系统的研究虽起步晚，但到现在已是非常成熟，并得到了广泛的应用[40]。如Li等[41]以枯草杆菌为宿主，高效表达和分泌嵌合肽Abaecin。将TeV导入到融合基因中，为Abaecin的表达提供了良好的环境，因此重组Abaecin在细菌细胞培养中表达水平较高(约为1 g/L)。枯草芽孢杆菌表达系统也存在一些缺点[42]，如质粒不稳定性、外源蛋白生产水平低等，这限制了其应用潜力。启动子是该表达系统的一个重要部件，直接决定着高水平的基因表达。枯草芽孢杆菌表达系统常使用的启动子分为两种：诱导性启动子和组成型启动子[43]。组成型启动子是指可以连续表达的启动子，如Papre、Plapsd等。这种启动子可以表达高质量蛋白且成本低。诱导性启动子是指可以根据特定的诱导剂来诱导表达，它又分为环境型诱导启动子和化学诱导型启动子[44]。

4 抗菌肽的应用前景

抗菌肽因其抗菌谱广、分子量小、不易产生耐药性、抗肿瘤、抗病毒等各方面的优点，应用范围非常广阔，如食品、医药开发、畜牧业、农作物等。而且在各个方面其应用潜力都非常的巨大，给人们带来的经济价值不可估量。

4.1 在食品方面的应用

抗菌肽作为一种天然的食品添加剂，其抗菌谱广、无残留等优点，在食品中具有巨大的应用潜力。近几年，中国越来越强调食品安全，而抗菌肽的开发与应用必将给食品安全领域带来革命性的风暴。抗菌肽可应用于食品原料的安全控制、食品防腐保鲜、食品加工、功能食品等方面。在食品原料的安全控制方面，可使用抗菌肽来替代抗生素制作饲料，或者将抗菌肽的相关基因整合到水果蔬菜中增强其抗病虫害，从而减少农药残留来增加食品的安全性，如宦海琳等[45]将抗菌肽添加到饲料中饲喂仔猪，结果发现仔猪的总蛋白血清含量显著增高，提高了仔猪的免疫力，促进了仔猪的生长。刘莉如等[46]在海兰褐仔公鸡上同样发现这种功效。在食品防腐保鲜方面，抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或兼性菌都具有杀伤作用，且抗菌肽在人体内易消化分解、无残留，是一种非常好的生物型防腐剂。Rivas等[47]发现将抗菌肽Sakacin Q涂抹在熟猪肉表面能够有效抑制李斯特菌并保存一段时间，且对肉制品主要成分并没有影响其功效性。有研究发现抗菌肽在牛奶、水果中、水果汁中都展现出较好的保鲜效果[48]。

4.2 在医药方面的应用

抗菌肽因其具有广泛的活性、较小的毒性和降低靶细胞的耐药性而被认为是一种很有前途和潜在的候选药物。治疗非传染性疾病的一个根本新策略是调节宿主的免疫反应，以加强对感染性物质的清除，并减少炎症所致的组织损伤。抗微生物宿主防御肽因其作为一类新型抗菌药物的潜力而受到人们的广泛关注，抗菌肽日前在这方面也取得了相当不错的成绩，已有十余种抗菌肽被开发为药物，并已应用于临床研究，如将抗菌肽Magainin[49]开发出来的药物接近完成第三期的临床研究，其对肿瘤病毒都展现出良好的杀伤效果。根据黄自然等[50]的研究，他们将柞蚕抗菌肽制成“肾肝宁”胶囊治疗肾炎及肝炎，并做了100例的乙型肝炎临床试验，综合各个指标的综合评定，其治愈率达到了80%多，也没有发现任何的毒副作用。又如器官移植排斥反应可通过抑制哺乳动物的雷帕霉素(MTOR)或环孢菌素来抑制钙调神经磷酸酶，从而减少T细胞信号转导，还有许多其他的小分子，如核因子kb(Nfkb)、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和jak-stat等也正在进行临床试验。Peng等[51]用毕赤酵母高效表达人类鹅型溶菌酶2(Hlysg 2)，对多药耐药微生物具有治疗作用，他们采用甲壳素亲和层析和大小排除层析法制备rhlysg 2，其产率达到137 mg/L，纯度>99%，为未来开发新型药物奠定了基础。

4.3 在畜牧业方面的应用

抗菌肽在畜牧业上的应用也较为广泛，可以用于饲料添加剂、改善动物的生产性能、有效预防并治疗畜禽疾病等。将抗菌肽添加到饲料中，可以维持动物的肠道菌群平衡，抑制有害微生物的生长，使动物的小肠绒毛变长、肠壁变薄，从而促进动物的生长。刘莉如等[46]研究表明，在饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽可显著提高海兰褐仔公鸡小肠黏膜绒毛高度、黏膜厚度和肌层厚度以及降低隐窝深度，有效改善小肠黏膜结构，而且提高了小肠免疫活性细胞的数量，促进其生长；宦海琳等[45]同样将抗菌肽加入到饲料中来饲喂仔猪，结果发现加入了抗菌肽组的仔猪其血清总蛋白含量和谷丙转氨酶活性比抗生素组显著增高，而且也可以在一定程度上增高十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度，促进仔猪的生长。丁修良等[52]在饲粮中添加300 mg/kg抗菌肽Sublancin，发现可提高养分利用率，减少肉鸡肠道中的有害细菌数量，从而提高肉鸡的生长性能。苏凯等[53]将一定量的抗菌肽添加到断奶仔猪的基础日粮中，结果表明，血清IgG水平和抗氧化能力显著高于对照组，且试验组的死淘率也明显降低，所加抗菌肽显著提高了断奶仔猪的生产性能和健康水平。

4.4 在植物抗性方面的应用

环境中存在的病原微生物会对植物造成持续性的威胁，但通过编码AMPs基因的转基因表达就能提高对多种植物病原的抗性。据报道，AMPs已成功在烟草、香蕉和马铃薯等植物系统中被表达，并用于生产药物肽和培育对几种植物病害具有抗药性的转基因植物。目前，在植物抗病系统中成功表达的抗菌肽有D4e1[54]、Esculestin[55]、MSI-999[56]、人乳铁蛋白[57]、Shiva-1和Sb-37[58]等。Ganapathi等[59]将抗菌肽麦甘宁、MSI-99转入到植物中来增强其抗病原真菌，如黑曲霉在转基因马铃薯品种中的应用。Wang等[60]将来自虾中的抗菌肽基因Np3和NP5整合到水稻中，使水稻对白叶枯病具有广谱抗性。

5 展 望

抗生素给人类和畜禽养殖业带来了很大的福祉，但其滥用也导致了许多问题，如“超级细菌”的出现、环境污染、药物的残留等，且在2018年4月16日，农业农村部兽医局局长冯忠武在中国饲料发展论坛上表示，药物饲料添加剂将在2020年全部退出[61]。因此研发具有绿色、高效、低毒、广谱的抗菌制剂已成为中国乃至全球的热点。在科研人员的不断努力下，越来越多的新型抗菌肽不断被发现，人们对天然抗菌肽的修饰也极大地提升了抗菌肽的抗菌能力。大量研究结果也表明，抗菌肽在各方面的应用将掀起一场“革命性”的风暴。

但与此同时抗菌肽还有许多问题亟待解决，首先是抗菌肽的来源问题，天然抗菌肽含量极微，且提取工艺较复杂；人工合成的抗菌肽与天然抗菌肽的结构存在差异，无法最大限度的发挥其生理活性，且成本高；基因工程表达方面也存在表达量低以及表达的产物可能对宿主产生危害等的问题；其次是抗菌肽在机体内稳定性的问题，由于抗菌肽的一级结构具有赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸，使其在机体内容易被胰蛋白酶消化水解，从而在一定程度上限制了其抗药物感染的使用；最后是其耐药性的问题，抗菌肽在接触病原体时，会产生耐药性机制，这种机制包括微生物对抗菌肽的应激协同反应，蛋白酶所介导的耐药性，细胞内外靶位的修饰和抗菌肽的外排作用等[17]。要将抗菌肽完全替代抗生素虽然存在一定的难度和问题，但“减抗”、“替抗”的大势已定，以后可以采用抗生素与抗菌肽的复合使用来减少抗生素的添加，再慢慢过渡到完全替代抗生素的阶段。

我们也相信随着科学技术的进步发展，在以后定能够找到一种成本低且能高效表达抗菌肽的系统，更加安全、稳定的包被技术以抵抗体内各种酶的水解，以及发现抗菌肽在体内发挥其药物作用的更深层次机制，让抗菌肽为人类创造出更加巨大的应用价值。