奶牛壳聚糖乳头保护膜药浴剂的制备及临床应用效果研究

2020-07-02姜鸿瑞梁焕结周静鹏韩紫音毛永江冀德君杨章平张慧敏

家畜生态学报 2020年6期

姜鸿瑞，姜惠，梁焕结，周静鹏，韩紫音，毛永江，冀德君，杨章平，张慧敏

(扬州大学动物科学技术学院，江苏扬州 225009)

奶牛乳房炎是奶牛业危害最大，也是最常见的疾病之一，它不仅影响奶牛的健康状况，而且影响牛奶品质，给农民和乳制品行业带来巨大的经济损失[1]。病原微生物是诱发奶牛乳房炎的主要原因之一，迄今为止已发现了150余种乳房炎致病菌，其中大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、蜡样芽胞杆菌等比较常见[2-3]。这些致病菌通过乳头导管入侵，引起感染。目前，注射抗生素是治疗奶牛乳房炎最常用的方法，然而长期使用抗生素会导致奶牛出现抗药性，最终引起奶牛乳房炎的复发和慢性感染[4]。所以有必要对奶牛乳房进行有效的保护，预防乳房炎的发生。

目前最有效的预防手段是乳头药浴剂，常见的主要有过氧化物类、碱类、碘与碘化物、含氯化合物、季铵盐类等[5]，它们大都是水溶液型，杀菌力维持时间短，且长期使用可对乳头皮肤有刺激作用[6]。为此，本试验室前期研制了一种成膜性奶牛乳头药浴剂，使用该产品后在乳头上形成一层保护膜，可有效防止细菌侵入，从而预防乳房炎的发生[7]，但其主效杀菌成分为聚维酮碘，含量较高，存在牛奶中碘残留的隐患，对食品安全有一定影响[8]。

壳聚糖是一种天然聚阳离子多糖，无毒无害，具有良好的生物相容性和成膜特性，广泛存在于甲壳类动物、节肢动物中[9]。壳聚糖及其衍生物具有抗感染、抗肿瘤、降血脂、增强免疫功能和抗菌等多种作用[10]。但不同相对分子质量壳聚糖的抑菌效果不尽相同，Asli等[11]发现相对分子质量为(1.3～4.0)×103的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效果要优于相对分子质量为(0.4～0.6)×103的壳聚糖。目前，已有报道表明相对分子质量为(50～90)×103的壳聚糖与邻氯青霉素复配使用，可有效地抑制金黄色葡萄球菌[12]。可见壳聚糖在防治奶牛乳房炎方面具有巨大的应用潜力。

因此，本研究首先考察不同相对分子质量的壳聚糖对奶牛乳房炎致病菌的体外抑菌效果，然后以壳聚糖和聚维酮碘为主效消毒成分研制奶牛乳头保护膜，通过体外抑菌试验及奶牛临床试验，评价壳聚糖乳头保护膜对奶牛隐性乳房炎的预防效果，该研究以期为扩大壳聚糖在奶牛乳房炎防治方面的应用，开发壳聚糖相关的绿色兽药产品提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

大肠杆菌(EscherichiacoliNBRC102203)、绿脓杆菌(PseudomonasaeruginosaDSM 50071)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC12600)、无乳链球菌(StreptococcusagalactiaeATCC 13813)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaDSM 30104)、蜡样芽胞杆菌(BacilluscereusATCC14579)菌株由本试验室保存。

1.2 试剂

壳聚糖(5～350)×103，脱乙酰度为91%～92%)购自浙江金壳药业有限公司；成膜性乳头药浴剂由本试验室研制，由成膜材料、抑菌成分、保湿成分等组分构成；对照组为市场上常规药浴液聚维酮碘，购自南京日升昌生物技术有限公司。

1.3 微生物的培养

将金黄色葡萄球菌和无乳链球菌液接种于血平板琼脂培养基中，其余菌种接种于普通琼脂培养基中，37 ℃培养24 h。

1.4 壳聚糖水溶液的制备

称取12 g壳聚糖加入98 mL无菌水、2 mL乙酸，使其溶解，调节pH至6.0～7.0。

1.5 壳聚糖保护膜的制备

乳头保护膜的具体配制方法参照文献[7]并稍作修改，其中壳聚糖的终浓度分别为0.0%、0.5%、1.0%、1.5%，聚维酮碘的终浓度均为4.0%。

1.6 最低抑菌浓度(MIC)的测定

在试管中将6种菌液的浓度稀释至106CFU/mL左右，加入壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液的浓度依次稀释成8%、4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%。37 ℃震荡培养12 h，最后一个无菌生长的试管所对应的壳聚糖浓度即MIC。

1.7 抑菌效果评价

取150 μL菌液(106CFU/mL)涂布于相应的培养基中，在平皿内打孔(直径为7.58 mm)，每板2个，将不同相对分子质量的壳聚糖或保护膜溶液分别注入孔内，37 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径。

1.8 乳区对比试验

选取处于泌乳期的健康中国荷斯坦奶牛48头，每头奶牛左侧2个乳区作为试验组，右侧2个乳区作为对照组。每次挤奶后，分别浸入壳聚糖乳头保护膜药浴剂和普通碘制剂中药浴3 s，每天3次，试验持续期为28 d。于试验0、7、14、21、28 d分别进行LMT隐性乳房炎检测[13]。此外于试验0、14、28 d分乳区收集奶样，采用多功能乳成分快速分析仪(MilkoScan FT120，FOSS)进行乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、总固体含量和SCC测定。

1.9 数据处理

采用Excel 2010整理数据，采用SPSS 16.0中的单因素ANOVA方差分析模型，分析壳聚糖不同相对分子质量或不同添加量对6种致病菌抑菌效果的影响；乳区试验中试验组和对照组间乳成分、SCC和SCS的差异用t检验法进行分析。试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同相对分子质量壳聚糖的抑菌活性

MIC试验结果见表1。不同相对分子质量的壳聚糖对6种乳房炎致病菌均有抑制效果，其中50×103壳聚糖针对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的MIC最低，为0.25%，针对其余4种致病菌的MIC为0.50%，较其他相对分子质量壳聚糖的MIC低。5×103和350×103的壳聚糖MIC范围在4%～8%，显著高于其他相对分子质量壳聚糖的MIC。而150×103的壳聚糖MIC范围在0.50%～1.00%之间，略高于50×103壳聚糖的MIC。

将不同相对分子质量的壳聚糖进行抑菌试验，由表2可以看出5×103的壳聚糖对6种致病菌均无抑制效果，50×103、150×103和350×103的壳聚糖对6种致病菌均有不同程度的抑制作用。三者均对大肠杆菌的抑菌作用最强，对肺炎克雷伯菌的抑菌作用最弱。方差分析表明：壳聚糖的相对分子质量对6种致病菌的抑菌效果影响极显著(P<0.01)，其中50×103壳聚糖对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、蜡样芽胞杆菌的抑菌圈直径要显著大于150×103和350×103的壳聚糖，对大肠杆菌和无乳链球菌的抑菌效果要显著高于350×103的壳聚糖(P<0.05)。结合MIC和抑菌效果试验结果，发现相对分子质量为5×103的壳聚糖对奶牛乳房炎常见致病菌具有较好的抑制效果，将其应用于下一步的壳聚糖保护膜试验中。

注：同行数据上标字母相同表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:The same letter superscripts in the same row mean insignificant difference, different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same below.

2.2 壳聚糖乳头保护膜药浴剂的抑菌试验结果

由表3可知，不同壳聚糖添加量的保护膜对6种致病菌均有不同程度的抑制作用，0.50% 壳聚糖添加量的保护膜对肺炎克雷伯菌的抑菌作用最强，1.00%和1.50%添加量的保护膜则对蜡样芽胞杆菌的抑菌作用最强。无壳聚糖添加组对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌的抑菌效果显著低于1.00%和1.50%添加组(P<0.05)；1.00%和1.50%添加组对6种致病菌的抑制效果无显著差异(P>0.05)。因此，可采用1.00%壳聚糖添加量的乳头保护膜药浴剂开展临床试验。

表3 不同壳聚糖添加量的乳头保护膜对6种致病菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial effect of teat dips with different chitosans content mm

2.3 隐性乳房炎的发病情况

由表4可知，对照组可疑及阳性乳区数量虽在7 d时出现了下降，但随后一直上升，最后由试验前的6个增至14个，占总乳区数的14.58%。试验组的可疑及阳性乳区在7 d和21 d时出现了下降，但最后由试验前的8个增至9个，占总数的9.38%，增幅远远低于对照组。与对照组聚维酮碘药浴剂相比，试验组壳聚糖乳头保护膜可有效地预防隐性乳房炎。

2.4 SCC及SCS变化情况

试验前后牛奶中的体细胞数检测结果见表5。0、14、28 d时，对照组和试验组之间的SCC及SCS均无显著差异(P>0.05)。从不同时间段来看，对照组3个时间段的SCC变化不显著，而试验组14 d的SCC显著低于0 d(P<0.05)；14 d和28 d对照组和试验组的SCS均显著低于0 d(P<0.05)。结果表明壳聚糖乳头保护膜药浴剂能很好的降低乳中的体细胞数。

表4 LMT检测结果Table 4 The result of LMT test

表5 SCC及SCS检测结果Table 5 The result of SCC and SCS

注：同行数据上标*表示差异显著(P<0.05)；同列数据上标字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: In the same row, values with * mean significant difference (P<0.05). In the same column, values with the same or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), while different lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.5 乳成分变化情况

乳成分检测结果见表6，0、14、28 d时，对照组和试验组之间的乳成分指标均差异不显著(P>0.05),表明壳聚糖乳头保护膜药浴剂对乳品质无显著影响。

3 讨论

乳头药浴剂是一种预防乳房炎的有效措施。挤奶后乳头迅速浸泡药浴剂，可有效杀死病原菌，从而预防乳房炎的发生。目前常用的药浴剂大都含有高剂量的碘，它对乳头皮肤有一定的刺激性，且络合碘中所用的表面活性剂长期使用还存在一定的毒性[14]。因此后药浴液在具有足够杀菌力的同时，要求碘的含量要低。壳聚糖是一种可降解的生物大分子，它无毒无害，且具有良好的抗菌性能，已广泛地应用在食品、药品及饲料等行业中。此外，壳聚糖还具有良好的成膜特性[15]，将其引入成膜性乳头药浴剂中，不仅可以提高杀菌效果，降低碘的含量，同时又可以促进膜的形成，改善成膜性药浴剂在乳头上出现的“下滴现象”。

表6 乳成分检测结果Table 6 The result of milk composition determination %

许多研究表明，壳聚糖的抑菌效果与相对分子质量的大小有关，低相对分子质量的壳聚糖可进入细胞内部，吸附细胞质内的阴离子，发生絮凝作用，干扰细胞新陈代谢进而杀死细菌，而高相对分子质量的壳聚糖可吸附在细胞表明，形成一层高分子膜，阻碍营养物质的运输从而达到杀菌作用[16-17]。由于不同细菌细胞壁结构的不同，所以不同相对分子质量壳聚糖对细菌的抑制程度也不尽相同。MIC试验结果表明，相对分子质量为5×103和350×103的壳聚糖对6种乳房炎致病菌的抑制效果不明显。而50×103的壳聚糖对6种致病菌的抑制效果较好，它对乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的MIC为0.25%，而随着相对分子质量的上升，壳聚糖对6种致病菌的抑制效果又逐渐下降。该试验结果与胡瑛等[18]的研究结果相一致：随着相对分子质量的升高，壳聚糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑菌活性先升高后降低。抑菌圈试验结果显示，50×103壳聚糖对奶牛乳房炎常见致病菌具有较好的抑制效果，而5×103的壳聚糖对6种致病菌没有抑制效果，该研究结果与宋献周和沈月新[16]报道一致，相对分子质量小于5×103的壳聚糖不仅对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有抑菌作用，反而能促进细菌的生长。分析原因可能是壳聚糖小分子可进入细胞内部，不仅不干扰细菌的新陈代谢，反而作为一种多糖物质，促进细菌的生长增殖。

将壳聚糖加入至试验室前期研发的成膜性乳头药浴剂中，通过抑菌圈试验发现，添加1%相对分子质量为50×103壳聚糖的药浴剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、蜡样芽胞杆菌的抑菌圈要显著大于未添加壳聚糖的对照组。体外抑菌试验显示乳头药浴剂中加入壳聚糖可有效的提升保护膜的抑菌效果。临床试验采用的是乳区对比试验，将同一头牛的左右乳区分别浸入壳聚糖乳头保护膜药浴剂和聚维酮碘药浴剂，降低了奶牛个体差异对试验的影响，使得结果更加准确。试验28 d后，试验组和对照组隐性乳房炎的发病率分别为9.38%和14.58%，可见试验组的隐性乳房炎发病率明显低于对照组。

SCC是衡量奶牛感染乳房炎严重程度的一个关键指标，但由于其偏态分布，在科学研究和生产中常将其转化为属于典型正态分布的SCS[19]。目前，大多数国家均将它们作为奶牛乳房炎抗性的一个主要性状加以追踪[20]。本研究发现，试验28 d后，试验组的SCC从130.01×103/ mL下降至73.34×103/mL，SCS从1.28下降至0.85，而对照组的SCC降低不显著。由此可看出，与对照组10%的聚维酮碘药浴剂相比，试验组的壳聚糖乳头保护膜药浴剂虽然仅含有4%的聚维酮碘，但可有效地预防隐性乳房炎。与普通水溶性药浴剂相比，成膜性乳头药浴剂预防隐性乳房炎的效果更佳，因为它可在乳头表面形成一种长效抗菌保护膜，缩短乳头管的开放时间，从而有效降低致病菌入侵的几率，同时在两次挤奶间隙保护乳头，防止垫料、饲料等环境性致病菌的侵入[21]。