乳酸菌的分离鉴定方法及益生功能应用研究

2020-12-18杨晓萍陈梓琦钟先锋

农产品加工 2020年13期

杨晓萍，陈梓琦，钟先锋

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528000）

乳酸菌分布于自然界中，常发现于植物、动物中，在食品、泥土及河流湖泊等也有发现，是自然界中普遍存在的细菌。乳酸菌应用的历史悠久，《齐民要术》中记录的咸肉、肉酱及甜酱菜便有乳酸菌的参与。大量研究证明，乳酸菌具有多种重要功能，如降低胆固醇、抗氧化、抑菌、耐药性、降亚硝酸盐等作用。阐述乳酸菌概况、分离鉴定方法、益生功能和主要应用领域进展，为乳酸菌的深入研究应用提供一定的理论基础及参考。

1 乳酸菌概述

乳酸菌是一群通过碳水化合物，在代谢过程中发酵产生乳酸的革兰氏阳性、无芽孢且厌氧的细菌总称[1]。从分类上看，形态上可分成球菌和杆菌。球形乳酸菌包括糖球菌属、肠球菌属、链球菌；杆状菌包括肉食杆菌属、乳杆菌、双歧杆菌等；从来源上分，大致可分为植物源乳酸菌和动物源乳酸菌[2]。从发酵类型上看，可分成同型发酵和异型发酵[3]。乳酸菌有18个属，其中链球菌属和乳杆菌属是最主要的2个属。随着食品生物技术的发展，科学家对乳酸菌的研究越来越关注在重要应用功能及潜在经济价值上。同时，人们也不断注重乳酸菌在食品工业、饲料工业及医疗领域中的开发和应用[4-5]。

2 乳酸菌的分类鉴定方法

2.1 表型鉴定法

表型特征鉴定方法主要包括抗菌谱试验分类法、化学分类法、双歧杆菌的酶学鉴定法、形态学观察与生理生化特征鉴定法[6]。形态学观察和生理生化鉴定是最关键也是最常用的菌种分类与鉴定环节。形态学观察主要是观察菌株菌落形态及菌体形状，如菌落的大小、颜色、凸起状况、菌体是否有鞭毛和芽孢等。随着近年来糖类生化反应板的研制成功，生化鉴定已由繁变简，并大范围推广使用，其中API系统是种类最多且运用范围最广泛的细菌快速分类系统。此外，还可利用抗菌谱试验及酶系鉴定等方法鉴定乳酸菌。抗菌谱试验的原理是根据不同乳酸菌抗菌谱和抗菌剂敏感度的差异性，对乳酸菌作出相应分类[7]。化学分类法则是通过测定乳酸菌的代谢产物及菌体组分来鉴定菌种[8]。双歧杆菌的鉴定可利用酶学鉴定法。双歧杆菌代谢产生果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（Furctose-6-phosphatephosph-oketolase，F6PPK），细胞在超声破碎后，游离的F6PPK可使果糖-6-磷酸盐生成乙酞磷酸盐，后者和FeCl3相结合为氧酸盐，产物显红褐色或红紫色，借此鉴定双歧杆菌。

2.2 基于16S rRNA基因序列分析的分子生物学鉴定方法

研究表明，原核生物有3种rRNA，分别是23S rRNA，16S rRNA，5S rRNA。16S rRNA位在于所有原核生物中，功能与结构都具有极大的“保守性”，被称为“细菌活化石”[9]。16S rRNA的核苷酸数量大小约1 500 bp，大小较合适，同时含有相对可变区域与高度保守区域，根据相对可变区域可揭示细菌菌种的差异性，根据保守区域的同源性分析可知菌种之间的亲缘关系[10]。因此，通过对16S rRNA基因保守区域和可变区域的比对可确定其系统进化关系。使用细菌通用正向引物27F和反向引物1492R，以细菌基因组为模板，适当条件下进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），产物检验合格后进行测定序列，通过比对获得的序列信息与数据库中同源性相近的基因序列信息，确定菌株的系统进化地位[11]。目前，常结合形态学、生理生化试验与16S rRNA基因测序分析方法对细菌进行分类鉴定。

2.3 应用于乳酸菌鉴定的其他分子生物学技术

由于核酸测序技术不断发展，多种分子生物学技术广泛应用于乳酸菌的快速鉴定，应用较多的有DNA的G+C含量测定法、DNA-DNA同源性（或杂交）分析法、DNA指纹图谱技术等技术[12]。

自然界中，每种生物DNA中G（鸟嘌呤） +C（胞嘧啶）含量是特定的。因此，细菌DNA中（G+C）摩尔分数值被认为是细菌的一个普遍遗传特征，并使用DNA（G+C） mol%表示。研究表明，细菌种间的DNA（G+C）mol%小于5 mol%，同属细菌的则不大于12 mol%；原核微生物的DNA（G+C） mol%值为 20～80 mol%，真核微生物的为 30～60 mol%[13]。

微生物的基因组在进化过程中会逐渐改变。DNA-DNA同源性分析法或杂交法主要是依据微生物DNA核苷酸序列的杂交程度或互补程度来判断细菌与细菌间基因型的相似性，进而推断细菌的遗传进化关系[14]。试验证明，DNA-DNA同源性分析法能够区分生理生化试验不易区分的细菌[12]。

DNA指纹图谱技术（DNA finerprintin gtechnique）主要有基于基因组重复序列的PCR技术（Repetitive Extragenic Palindromic PCR，REP-PCR）、基因组DNA限制性片段长度多态性分析（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel ectrophoresis，DGGE）和随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD） 4 种[12]。REP-PCR 技术应用普遍，首先需扩增细菌DNA中分布最广的短重复序列，凝胶电泳并观察产物条带，其不同分布表明不同细菌的DNA差异性。该方法操作简单，可大样本量进行。RFLP方法使用限制性内切核酸酶将细菌全基因组DNA进行酶切，根据酶切片段长度的多样性鉴定细菌种属[15]。DGGE方法是利用DNA中核酸的不同碱基变性温度不同，通过不同的电泳条件，将碱基排列顺序不同的DNA片段分开[16]。RAPD方法是利用大小约为10 bp的小寡核苷酸引物，使之在较低退火温度下，与其同源性最高的DNA序列结合，产物进行PCR扩增，电泳后观察图谱，根据图谱的多态性鉴定微生物[17-18]。

3 乳酸菌的功能

3.1 降低胆固醇作用

某些乳酸菌株能够降低体内胆固醇含量，长时间食用含乳酸菌的食品或乳酸菌发酵食品可在一定程度上降低血液中的胆固醇含量，从而有效降低心血管疾病的发病率[19]。马长路等人[20]从传统东北酸菜中分离筛选出的MHS1701，MHS1703，MHS1706乳酸菌株的胆固醇清除能力分别达41%，53%，41%。吴海珍等人[21]用高胆固醇质量浓度（1.0 mg/mL）从18株乳酸菌中分离出胆固醇清除率最高为41.50%的JY20菌株。孙博瑞[22]利用OPA法测定出10株乳酸菌中降胆固醇能力较稳定的为屎肠球菌GU983697。任大勇等人[23]筛选得到6株高胆固醇清除能力的菌株C1，C2，H6，H9，L22，L30，清除率均在85%以上。

3.2 抗氧化作用

乳酸菌作为天然食品添加剂能缓解机体氧化应激，预防某些疾病。Zhao D，Furumoto H等人[24-25]试验发现某些乳酸菌能够清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、羟自由基等活性氧自由基从而缓解细胞氧化应激。吴石金等人[26]分离出1株具有优良抗氧化性的短乳杆菌ZJ401。肖宇等人[27]从藏灵菇中分离出8株抗氧化能力优良的菌株发酵乳。王帅等人[28]在泡菜中分离得到2株（Kc6，Kc13）具有高抗氧化性功能的乳酸菌菌株。高畅等人[29]通过研究发现富硒乳酸菌中药制剂可以大大提高育肥猪免疫能力和血清及组织的抗氧化能力。

3.3 抑菌作用

一些乳酸菌的代谢产物具有抑菌作用。梁晓明等人[30]试验发现副干酪乳酸菌S-4产生的有机酸对4株致病弧菌均具有显著的抑制作用。朱建宁等人[31]从牦牛曲拉分离出6株乳酸菌，发现菌株Q2对大肠杆菌的抑菌能力最强。陈凯等人[32]发现乳酸菌S60和S72对水产动物常见病原菌嗜水气单胞菌等均有抑制作用，其有效抑菌物质与有机酸类相关。吴爱娟等人[33]从传统酸奶筛选出的1株植物乳杆菌B6所产生的Ⅱb类细菌素具有广谱抑菌性。

3.4 耐药性作用

乳酸菌可由自身基因突变获得耐药基因或从外界得到耐药基因，从而具有耐药的功能。吕耀龙等人[34]研究发现，内蒙古达茂旗牧区牛乳中乳酸菌菌株DM21对部分抗菌药物具有较高的耐药性，其耐药性与gyrA基因突变有关。王海清等人[35]研究发现，保加利亚乳酸杆菌（L.bulgaricus）和嗜热链球菌（S.thermophilus）对氨苄青霉素表现耐药性。党乔等人[36]在泡菜分离得到的34株乳酸菌对氨苄西林和氯霉素敏感。Yuksekdag Z H等人[37]分离出的24株乳酸菌对氨苄西林耐药率为56%。Aslim B等人[38]试验研究发现34株嗜热链球菌（S.thermophilus）对青霉素的耐药率为64%。

3.5 降亚硝酸盐作用

乳酸菌在食品发酵中表现出良好的降解亚硝酸盐功能。Fei Y等人[39]研究验证乳酸菌代谢产物亚硝酸还原酶及乳酸，可降解、清除亚硝酸盐。卿煜维等人[40]发现德氏乳杆菌在发酵罐恒定pH值6.0、培养24 h的亚硝酸盐降解率为98.9%。程方方等人[41]从辣椒酱分离出1株肠膜明串珠菌（Leuconostocmes enteroides），其亚硝酸盐降解率达88.91%。张兴吉等人[42]通过从西部牧区传统发酵乳品筛选得到的275株乳酸菌的试验发现，其中50%的乳酸菌亚硝酸盐降解率平均在91.3%以上。

4 乳酸菌的应用现状

4.1 乳酸菌在食品领域的应用

在食品领域抗生素泛滥的现状下，被认为安全、有效、无毒的乳酸菌逐渐成为学者们的研究热点，并广泛应用于肉制品、奶制品、蔬果制品及其他食品的生产。刘佳秀等人[43]从海洋鱼类中分离得到植物乳杆菌Y12，以单独接种与混合接种的方式接种于黄花鱼鱼肉，进行挥发性盐基氮测定及感官评分。结果表明，Y12具有良好的抑菌效果，可用于鱼肉保鲜。许女等人[44]将抗氧化活性强、产香及产黏效果好的凝结芽孢杆菌Z10和植物乳杆菌Z4应用于酸奶的生产制作，试验发现酸奶成品的抗氧化性增强、稳定性提高、凝乳的质地得到极大改善。邹华军等人[45]研究结果表明，乳酸菌发酵泡菜中过程中，试验组泡菜的亚硝酸盐峰值较传统泡菜的提前2 d出现，且峰值大小仅为传统泡菜的20%；乳酸菌能有效提高泡菜产品的安全性及缩短泡菜的生产周期。张梦寒[46]研究解淀粉芽孢杆菌JY06与其突变株E6、C12对酱油发酵过程中氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC，致癌物质）及其前体物瓜氨酸的降解效果，试验发现突变株E6与C12利用精氨酸的能力均高于JY06，且酱油产品中瓜氨酸分别下降14.7%和15.6%，氨基甲酸乙酯分别下降13.1%和19.3%。

4.2 乳酸菌在饲料领域的应用

禽畜的饲养离不开饲料，饲料含有畜禽所需的营养成分，能够促进畜禽的健康成长，缩短出栏期，提高农户的经济效益。侯鹏霞等人[47]研究全株玉米与新鲜马铃薯秧作为青贮原料在不同条件下处理的品质变化，结果表明马铃薯秧的添加量为20%～40%时，添加乳酸菌能降低饲料中龙葵素的含量，饲料的安全性与适口性更好。蔡义民等人[48]研究乳酸菌发酵剂对非洲产甘蔗秸秆及玉米秸秆混合发酵青贮饲料发酵品质的影响，发现添加乳酸菌后，饲料原料的营养无明显损失，饲料的发酵品质得以改善。刘凤美等人[49]研究发现，饲料中添加枯草芽孢杆菌、乳酸菌混合制剂，能促进肉鸡免疫器官健康发育，进一步提高肉鸡的免疫力和抗病能力。

4.3 乳酸菌在医药领域的应用

随着人们对乳酸菌功能特性研究的深入，越来越多益生乳酸菌被应用于医药领域。王林康等人[50]研究乳酸菌发酵中草药对产后母猪的临床效果，结果发现，大青叶、黄芪、蒲公英等药材经乳酸菌发酵，能够有效缩短母猪排恶露的时长，降低母猪宫内膜炎的患病几率，增加仔猪断奶体重。林晨辉[51]进行中药联合益生菌治疗慢性腹泻的临床研究，试验表明中药联合混合乳酸菌制剂能够有效治疗慢性腹泻，无副作用，优于西药治疗。王亮亮[52]对乳酸菌预防奶牛乳腺炎的机制进行了研究，试验表明，源于健康奶牛的3株益生乳酸菌，均能抑制金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞的感染、黏附及定植，最终达到预防或减轻奶牛乳腺炎感染的目的。