猪冷冻精液品质影响因素分析

张树山，韩雪峻，姜红菊，张德福*

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；3.上海种猪工程技术研究中心，上海 2013021）

近五年来，在猪精液冷冻保存技术飞速发展、国家政策及非洲猪瘟等几大因素合力推动下，依托大、中型种猪生产企业的冷冻精液商业化生产平台、销售及技术支持等完整产业链已初具规模，市场发展前景广阔。猪冷冻精液（简称“冻精”）能突破时空限制，使种猪生产企业能快捷地为客户提供优质冻精和售后技术支持，在提高引种效率和猪场生物安全性等方面意义尤为重大。众所周知，猪冻精的品质主要受精子耐冻性、冷冻稀释液以及冻精制作过程（包括精液采集、稀释、降温平衡、冷冻和解冻等）操作等因素影响，其品质是众多因素的合力的结果。文章就猪冻精制作涉及影响因素作一梳理，目的在于抛砖引玉、为从事猪精液冷冻保存技术研究及冻精商业化生产的同行提供一些参考。

1 公猪精液采集环节

1.1 公猪精子耐冻性

与其他畜种的精子相比，猪精子耐冻性的个体差异性更为显著。一个公猪站在规模化生产冻精前，一般要对所有公猪的精液进行冷冻试验（即精子耐冻性筛选），解冻后精子活力、顶体完整性和畸形率等指标达到标准的公猪可用于冻精生产。具有高育种价值的种公猪可降低筛选标准。

1.2 公猪采集精液品质

采精场地应该注意卫生、消毒，有条件的公猪站也可采用自动采精系统代替传统的采精方式，通过自动采精系统可以大幅度地降低精液中细菌含量。采精人员要严格遵守操作规范，只收集射精中第2段富含精子的乳白色精液。猪精液品质受季节、年龄和个体健康等因素影响，而原精品质是直接影响冻精制作成功与否的决定性因素之一。故技术人员必需重视原精的精液品质指标检测，还要注意观察精液颜色、气味、胶状物等是否正常，并作好记录。对有炎症以及老龄的公猪应该及时治疗或淘汰。

1.3 精液采集与预稀释

猪精液采集后应尽快检测原精液的密度和活力，并以预稀释液等温做1∶1稀释。在不同公猪站，原精送抵实验室的实时温度由运送时间和保温装置决定。在条件稳定的情况下，技术人员应通过多次测定精液运抵实验室的温度，参照该温度来设置水浴温度，从而能提前备好等温预稀释液，该温度可能随季节有所变化。

1.4 精子的预筛选

死亡精子会释放出H2O2，死亡精子数量的增多可加剧活精子遭受的氧化损伤程度，发生凋亡的精子受精能力也会大大降低甚至丧失。除把控好精液品质检测外，将精液中死亡或发生凋亡的精子去掉，对提高猪精液冷冻效果尤为重要。尽管关于精子筛选的相关研究起步较早，但大多方法要么适用于体外受精操作前的小体积精液处理，要么成本较高，如梯度离心法（如Pecoll法）和免疫磁珠法等。近几年瑞典研究人员研发出一种单层离心方法（Single Layer Centrifugation，SLC），被认为是一种适用大体积精液且效果较好的一种高品质精子筛选方法。然而，尚未查到该产品的具体上市信息。

2 降温平衡环节

2.1 降温平衡条件

精液采集、运抵实验室后，猪精液的降温平衡包括的室温、17 ℃和4 ℃ 3个阶段。与其他家畜精子相比，猪精子对外界温度变化更为敏感，温度的快速下降、波动和17 ℃平衡阶段温度低于15 ℃，都会对猪精子产生不利影响和“低温打击”。室温阶段：猪精液采集后立即送往实验室，一般将精液瓶/袋用毛巾作简单包裹、室温下静置1 h左右；17℃阶段：该阶段降温平衡被认为能增加猪精子的抗“低温打击”能力。除采用多层纱布或棉絮包裹外，也有采用水浴降温，即将精液瓶/袋没入与精液等温的水中，通过加冰块或逐步减少水量来提高降温速度。水浴箱要放置温度计并注意能实时观察降温情况（箱内水量越大降温速率越小），注意尽量排出精液瓶/袋中的空气并密封好，尤其注意精液温度不能低于15 ℃以下。4 ℃阶段降温平衡方法同17 ℃阶段。目前，已有可精确控制降温速率的降温平衡柜（如北京田园奥瑞生产的“程序控温平衡仪”）问世，将精液瓶/袋移至柜中，就能以一定的降温速率从精液温度平缓降温至目的温度，操作方便、尤其适用于冻精的规模化生产。

2.2 离心浓缩及两次稀释操作

17 ℃降温平衡结束后，即进行离心浓缩、等温添加含有鸡蛋卵黄的冷冻稀释液（Ⅰ液）。猪精液具有体积大、精子密度小的特点，必需通过离心（800× g，10 ～ 25 min，17 ℃）才能实现冷冻保存。但离心操作会导致部分精子因位于沉淀下部、紧贴离心瓶底而产生损伤。有人采用在离心时在离心瓶底部加入1～2 mL市售液体试剂（也称“缓冲垫”）的方法，可避免精子沉淀黏附在离心瓶底、减轻离心对精子的损伤程度，并能延长精液的离心时间、能有效避免离心后部分活力较好精子上浮至上清液，从而造成的精子损失。

4 ℃降温平衡后，等温添加含有冷冻保护剂的冷冻稀释液（Ⅱ液）。

冷冻稀释液Ⅰ、Ⅱ液应分别与降温平衡的精液置于同一处，确保等温稀释。稀释前，应分别将精液和冷冻稀释液上下颠倒、充分混匀；加入冷冻稀释液体积较大时，应分步稀释（即先加入部分稀释液混匀后再加入剩余部分、混匀）。

2.3 冷冻稀释液因素

在整个降温平衡和冷冻-解冻过程中，冷冻稀释液的因素不容忽略。其功能是为精子提供一个适宜的pH与渗透压和较低细菌数量的环境，且能为精子提供能量、增强其抗冷休克和抗冷冻损伤能力。

配制冷冻稀释液应注意：1）配制和分装稀释液的用具必须刷洗干净并进行严格消毒。2）试剂应该选择分析纯或化学纯，根据配方精确称量，配制稀释液最好使用pH 7.0左右的蒸馏水。3）卵黄要取自新鲜鸡蛋，不能混入蛋清或卵黄膜等杂物。4）配制好溶液后应检测pH和渗透压（如有条件）并调节至配方要求值。配制好溶液的pH偏差太大，说明溶液配制极有可能出现了失误，应重新配制。5）预稀释液、基础稀释液和解冻液等溶液配制好后要进行过滤（0.25 μm）或高压灭菌。抗生素、卵黄和酶类等成分，应在溶液消毒冷却后添加，或临使用前添加并充分搅拌。6）溶液配制好后应该密封并冷藏保存，1周内使用。

市售猪冻精稀释粉套装则对操作人员要求相对较低、使用方便，但成本高一些。配制冷冻稀释液时要严格根据说明书的提示进行。

3 冷冻降温环节

3.1 精液灌装、封口和装架

添加冷冻稀释液Ⅱ液后，即在低温条件（4℃）进行灌装、封口和装架等操作。在操作过程中，程控低温柜（成本高）或改造冰柜（结合控温器，成本较低）可能温度会上升，可采用放置冰块或盛有液氮的泡沫盒，并通过观察程控低温柜（改造冰柜）不同位置温度计及时调节温度。

3.2 冷冻降温操作

提前将程控冷冻仪打开，执行程序。将冷冻料架标记并码好，快速将其移至程控冷冻仪中，盖好即开始冷冻降温。程控冷冻仪应与程控低温柜（或改造冰柜）相邻，尽量减少冷冻料架移动距离，二者位置或高度等应根据技术人员喜好作调整。技术人员应该佩带护目镜、手套、防护围裙和套袖。冷冻降温结束后，依照冷冻料架标记，并将冷冻细管快速分别移至倒有液氮的泡沫盒中。启动精子程序冷冻仪加热程序，用于去除箱体中水蒸汽。

冷冻细管收集操作过程中，应注意冷冻细管和布袋均保持在液氮面以下操作。

3.3 设备的维护

与牛、羊等家畜相比，尽管使用离心浓缩方法，装管前，一般每头份猪精液仍可达几十毫升，多的可达100 mL以上。以0.5 mL细管为例，多头份精液的灌装、封口和打印等采用人工操作其劳动量极大，故加强相关设备定期保养、保持其正常运行对冻精的规模化生产非常重要。如：进行精液灌装、封口操作时，要注意仪器声音是否异常、打印机墨水余量（实验室要有备货以便及时添加）；低温操作柜在使用结束后，可以在其中放置电风扇减少灌装、封口和打印仪器内外水蒸汽，最后将小型移动式紫外灯置于低温操作柜内定时消毒。冷冻仪在冷冻降温程序结束后，要及时开启加热程序来减少其冷冻箱体内水分；此外，尤其在南方炎热地区，当冷冻仪与液氮罐之间连接管断开后，一些昆虫类（如蟑螂）可能会通过连接管的开口端进入到程控冷冻仪中，甚至能到达液氮喷嘴部位，可能会降低液氮喷速或堵塞。故当冷冻仪与液氮罐之间连接管断开后，应对连接管的开口端作密封处理。

4 技术人员因素

毛主席在《论持久战》中指出，决定胜负的因素是人不是物。在影响冻精品质的众多因素中，技术人员是冻精制作的最重要影响因素之一，几乎能影响到冻精制作的所有环节。 第一，要求技术人员有“干一行、爱一行、专一行”的工作态度和敬业精神，尤其要有忍耐寂寞的能力，才能在较封闭的种公猪站内能保持不急不燥的工作态度。第二，冻精制作过程中，溶液配制、稀释操作和降温平衡等操作均需要规范的操作技能和严谨的态度。故要加强对技术人员的培训、树立生物安全意识和认真的工作态度，善于学习并能从工作中发现并解决问题。第三，冻精整个制作流程至少需要2～3人默契配合，出现问题需要团队成员能各抒己见地提出自己观点、形成解决方案并执行。这就要求团队负责人能通过团队共同的、切实可行的愿景、制定完善的规章制度及营造相互信任的组织氛围等手段来建立一个高效、团结的团队，与团队每一位成员的努力是分不开的。

5 小结

猪冻精的商业化生产和应用已开始步入快车道，商品化冻精在优秀种公猪遗传资源突破时空限制、提高生物安全性等方面已显现出革命性推动养猪业飞速发展的先兆。当前，摆在冻精商业化生产者面前一个重要问题就是，如何利用现有成熟的猪冻精生产技术，依托日趋高效、完善的设备生产出高品质的冻精。依据“木桶效应”原理，整个冻精制作流程中每一个环节或影响因素都是“木桶”（即冻精品质）的一块木板，其重要性都不容小觑。故冻精生产管理者和技术人员应逐步理顺决定冻精品质的环节和因素，以系统工程理论指导，注重细节、从小处着手规范操作和针对影响因素对冻精制作流程逐步完善，通过积量变为质变提高猪冻精品质以及推动猪冻精技术更上一层楼！

参考文献（略）