组蛋白H3K27甲基化对人高分化鼻咽癌细胞系CNE-1增殖的抑制效应

蔡 波，邢娟娟，胡 蓉，任 欣，王 榕，吴恬宁，郭 菲*，陈少卿

(1.南昌大学第一附属医院 烧伤中心， 江西 南昌 330006； 2.南昌大学 江西医学院， 江西 南昌 330006；3.南昌大学附属中学， 江西 南昌 330029； 4.南昌大学第一附属医院 肿瘤科， 江西 南昌 330006)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁黏膜上皮的恶性肿瘤，具有明显的地理和种族分布特征，尤其是在东南亚和中国南部高发，在流行地区为最常见的致死性恶性肿瘤[1]。鼻咽癌的发生与多因素相关，局部复发和远处转移是成功治疗NPC的主要障碍[2]。目前放疗是鼻咽癌的首选治疗方法，但放化疗的毒副作用最大程度限制了其疗效，因此，寻找一种低毒又高效的抗鼻咽癌药物尤其重要。研究显示，组蛋白甲基化表观遗传失调已被证实为恶性肿瘤的一大特征，参与多种肿瘤的发病机制[3]。三甲基组蛋白H3K27(H3K27me3)广泛分布于全基因组中，尤其在沉默基因的启动子区域大量存在，通常参与靶基因的转录抑制[4]。GSK-J4是组蛋白H3K27me3/2 去甲基化酶JMJD3和UTX的新型选择性抑制剂，因其作用浓度低(微摩尔),对正常细胞几乎无毒性及其可逆性修饰优势，而在多种类型肿瘤中被用于研究[5]，它可以通过细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡来抑制细胞增殖，从而影响细胞的生物学特性[6-7]。本研究利用GSK-J4特异性抑制鼻咽癌CNE-1细胞内去甲基化酶，以观察CNE-1细胞增殖能力的变化并探索其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人鼻咽癌细胞系CNE-1(江西省分子医学重点实验室)。

1.1.2 试剂：RPMI-1640培养基(HyClone公司)；胰蛋白酶、PBS和CCK-8试剂盒(FC101)(北京全式金生物技术有限公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；DAPI染色试剂盒(Bioworld Technology公司)；RNAiso Plus、cDNA反转录试剂盒和RT-qRCR试剂盒(TaKaRa公司)；PI和RNase A(BD公司)；组蛋白H3K27去甲基化酶抑制剂GSK-J4(Selleck公司)；兔单克隆抗人H3K27me3抗体(CST公司)；山羊多克隆抗兔抗体(Alexa Flour®488)(Abcam公司)；CyclinD1、Ki-67和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(华大基因科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：用含10% FBS的RPMI-1640培养液将CNE-1细胞置于37 ℃、5% CO2饱和湿度恒温培养箱中培养，实验时选择对数增殖期细胞。将CNE-1细胞分为对照组和实验组, 对照组细胞给予含等体积溶剂DMSO(<0.1% v/v)的完全培养基处理,实验组用含0.5 mmol/L GSK-J4的完全培养基处理，分别于24、48和72 h，进行后续检测。

1.2.2 激光扫描共聚焦技术检测CNE-1细胞内H3K27me3蛋白的表达水平：将CNE-1细胞调整为5×104个/mL，接种爬片，设阴性组、对照组和实验组。贴壁后，对照组和阴性组均加入含DMSO的完全培养基，实验组加含0.5 mmol/L GSK-J4的完全培养基,48 h后检测细胞内H3K27me3蛋白的表达水平。细胞用4%多聚甲醛固定15 min，随后用0.5% Triton X-100透化10 min，2% BSA封闭30 min，再将细胞与相应的一抗在37 ℃下孵育2 h(阴性组加入2% BSA), PBS洗涤后，与Alexa Flour 488缀合的山羊抗兔抗体在37 ℃下孵育1 h，DAPI室温下复染15 min, PBS洗3次。最后将爬片倒置放在共聚焦显微镜观察。随机取每张爬片不重复的5个位置于镜下拍照，得到图片用OLYMPUS cellSens 1.16软件分析其吸光度。

1.2.3 RT-qPCR检测各组细胞中cyclinD1和Ki-67 mRNA水平：取每孔1×105个细胞接种于6孔板，隔日各实验组加相应条件培养基处理。24 h后用RNAiso Plus提取各组细胞的总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，用反转录试剂盒将1 μg总RNA反转录合成cDNA，再用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒在20 μL反应体系下进行实时荧光定量PCR反应检测细胞中cyclinD1和Ki-67 mRNA水平。cyclinD1上游引物为5′-TTGACTGCCGAGA AGTTGTG-3′,下游引物为5′-CTGGCATTTTGGAG AGGAAG-3′；Ki-67上游引物为5′-GCCAAGAACGC CTAAGGAAG-3′,下游引物为5′-TGGTGGAGATTTG CAGGCTA-3′；GAPDH上游引物为5′-CAGGGCTG CTTTTAACTCTGGT-3′,下游引物为5′-GATTTTGG AGGGATCTCGCT-3′。以GAPDH为内参照，PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火与延伸34 s，共40个循环。每个样3个复孔，采用Δ循环阈值(Ct)法处理结果，计算各组细胞中各指标mRNA的相对表达量，即2-ΔΔCt。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞计量术测定CNE-1细胞内H3K27me3的表达水平及观察细胞周期分布

1.2.4.1 流式细胞计量术测定CNE-1细胞内H3K27me3的表达水平:将CNE-1细胞按每孔1×106个细胞接种于6孔板，待细胞贴壁，各组换相应条件培养基处理72 h。胰蛋白酶消化离心后用4%多聚甲醛室温固定10 min，再用甲醇于-20 ℃重悬20 min，洗涤后用2% BSA封闭30 min。各实验组加入相应一抗孵育液室温孵育40 min (阴性组加入2% BSA)，根据分组，在阴性组和各实验组中加入二抗孵育液山羊多克隆抗兔抗体室温避光孵育40 min。最后以4%多聚甲醛固定细胞15 min，2% BSA洗涤后，流式细胞仪检测H3K27me3的表达情况，每组设置3个复孔。

1.2.4.2 流式细胞计量术观察CNE-1细胞周期分布:分组和处理同上，消化收集实验组细胞。PBS洗涤后加入于-20 ℃预冷的70%乙醇固定。离心洗涤后，经PI染液(含50 mg/L PI, 10 mg/L RNase A)悬浮细胞，室温避光孵育15 min，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测细胞周期，检测结果用Flowjo v10软件分析，每组设置3个复孔。

1.2.5 CCK-8检测人鼻咽癌CNE-1细胞的增殖活性：根据试剂说明书，人巨噬细胞GSK-J4的IC50值为9 mmol/L，据此本实验用含不同浓度GSK-J4(0～4 mmol/L)的完全培养基孵育CNE-1细胞。将CNE-1细胞接种于96孔板中，每孔3 000个细胞。贴壁后分别换上含0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L的GSK-J4处理细胞48和72 h, 含DMSO组为对照组，而没有细胞的组(只加入RPMI-1640完全培养基)充当阴性组，每个浓度5个复孔，放孵箱继续培养。GSK-J4分别作用48和72 h后, 按试剂盒说明书操作，检测各组在450 nm处的吸光度(A)。细胞存活率(%)= [实验孔的A值- 阴性组孔A值/对照孔的A值- 阴性组孔A值]×100%。

1.2.6 细胞平板集落实验观察CNE-1细胞集落形成能力：对照组和实验组细胞经相应条件培养基处理72 h，重新消化接种6孔板，每孔500个细胞，换正常培养基继续培养，最后按平板集落形成实验常规处理。拍照后用Adobe Photoshop CS6计数大于或者等于50个细胞的集落数量，每组设置3个复孔。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 GSK-J4作用后细胞内组蛋白H3K27me3水平明显上调

实验组细胞内组蛋白H3K27me3的平均荧光强度与对照组相比明显升高(P<0.05)(图1，表1)。

图1 GSK-J4作用48 h后细胞内H3K27me3蛋白的表达Fig 1 Expression of H3K27me3 protein in cells after 48 hours of GSK-J4

表1 培养48 h后细胞内H3K27me3的表达水平

2.2 GSK-J4显著抑制细胞内cyclinD1和 Ki-67 mRNA水平

实验组(0.5 mmol/L GSK-J4)细胞中cyclinD1和 Ki-67 mRNA表达水平与对照组相比明显降低(P<0.05)(表2)。

表2 GSK-J4处理24 h后细胞中cyclinD1和Ki-67 mRNA水平

2.3 GSK-J4明显抑制CNE-1细胞增殖活性和克隆形成能力

各实验组细胞增殖活力和对照组相比较明显下降(P<0.05)，并且抑制作用呈剂量依赖性关系(表3)；实验组细胞克隆形成数目[ (313.3±1.5) 个]明显低于对照组[(436.3±16.3)个](P<0.05)(图2)。

表3 细胞生存率

A.control group; B.experimental group(0.5 mmol/L GSK-J4)图2 细胞集落形成实验结果Fig 2 Cell colony formation experimental results

2.4 GSK-J4处理可以延长CNE-1细胞G0/G1期并缩短细胞S期

实验组(0.5 mmol/L GSK-J4)G0/G1期细胞数百分比与对照组相比明显升高(P<0.05)，而S期细胞数百分比与对照组相比明显降低(P<0.05)(表4)。

表4 GSK-J4处理48 h后细胞周期分布变化

3 讨论

细胞增殖受严格的细胞周期调控，局部组织的细胞内某些基因表达水平的异常改变会失去对其增殖的正常调控，导致克隆性异常增生，无限增殖是肿瘤细胞显著的基本特征之一。

组蛋白是一种小分子碱性蛋白质，为真核生物染色体的基本结构成分之一，在相关酶的作用下可以发生甲基化和去甲基化修饰，调节染色质状态和基因表达，从而调控组织细胞的分化和发育[8]。组蛋白H3K27广泛分布于全基因组中，其在细胞内甲基化水平主要受到组蛋白H3K27甲基转移酶(EZH2)和去甲基化酶(UTX/JMJD3)共同作用来维持稳定。据相关文献报道，组蛋白H3第27位赖氨酸残基的三甲基化(H3K27me3)作为抑制性标记在人类多种癌(如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和食管癌)的发生和进展中起关键作用，并与患者预后相关，组蛋白甲基化表观遗传调控失调已被证实参与多种肿瘤的发病机制[9]。GSK-J4是一种新型的特异性组蛋白H3K27去甲基化酶JMJD3和UTX的小分子抑制剂，最近被证实可以通过抑制组蛋白H3K27me3去甲基化，显著性抑制多种肿瘤的增殖，却对正常细胞毒性很小，甚至无毒性，如胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等[10-11]。这与本实验观察到的结果一致，即通过GSK-J4处理人鼻咽癌CNE-1细胞后，细胞内H3K27me3蛋白表达上升，同时显著性抑制CNE-1细胞体外增殖能力。

细胞周期调控在细胞生物学过程中发挥重要作用，细胞周期蛋白cyclinD1在正常细胞周期中参与DNA合成，促使细胞周期从G1期到S期的转换，常被认作为一种原癌基因[12]。相关文献报道，GSK-J4对组蛋白去甲基化酶的抑制作用影响了细胞活力和细胞周期进程，而且诱导细胞周期动力学改变的机制和能力因细胞的类型而有所不同[13]。Ki-67作为一种表达贯穿增殖期细胞的核抗原，在细胞有丝分裂的各期均有表达，是目前临床较为肯定的核增殖标志基因。研究表明，鼻咽癌组织中Ki-67呈高表达状态，在鼻咽癌的发生发展中起协同作用[14]。本研究通过检测实验组和对照组中cyclinD1和Ki-67 mRNA的表达水平，发现CNE-1细胞经GSK-J4作用24 h后，细胞内cyclinD1和Ki-67 mRNA的表达水平均显著性下降。同时流式细胞周期实验结果显示经GSK-J4处理后，细胞在G0/G1期阻滞。提示GSK-J4可能是通过下调cyclinD1、Ki-67的表达水平,诱导细胞周期阻滞，从而抑制CNE-1细胞增殖。目前，鼻咽癌的治疗仍然是以放疗为主，但放疗抗性已被确认为放疗失败的主要原因[15]。其次，任何形式的放疗都不可避免地存在一定的毒副作用，最大程度限制了其疗效。近年来，表观遗传学在肿瘤治疗中获得重大进展，但在鼻咽癌治疗的研究方面却非常少见，有文献[9]对H3K27me3在NPC中的表达动力学及其临床病理学和预后进行了报道，但未进一步对相应生物学现象和分子机制进行研究。本研究通过调控表观遗传学修饰，揭示了GSK-J4抑制鼻咽癌细胞体外增殖的可能机制，为临床鼻咽癌的治疗提供理论依据和新靶点。但GSK-J4能否在蛋白水平也下调cyclinD1和Ki-67的表达以及cyclinD1和Ki-67 mRNA表达下降是否与GSK-J4上调细胞内组蛋白H3K27甲基化水平有直接关系还有待进一步研究。