正源抗栓蜜丸对角叉菜胶致小鼠尾部血栓的作用研究

林希钒 王 振 何世勇 官睿璇 张 琳 郁万刚

1. 大连医科大学中西医结合学院，辽宁 大连 116044；2. 大连市中医中科研究院，辽宁 大连 116021

脑卒中是世界范围内的一种高发性、高危性脑血管疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占87%，其1年内的致死率约10%，致残率也高达34%[1]。中国缺血性脑卒中患者数目庞大，年轻化明显，病死率和复发率远高于世界平均水平，是家庭和社会的沉重负担。近年来，我国积极开展脑卒中的防治工作，不断加大对于脑卒中临床和基础研究的投入，取得了一定成绩，但国内脑卒中防治局势依然严峻，防治手段有待进一步优化[2-3]。

血栓指血管内有形成分相互作用、聚集所形成的团块状固体，依据其形成部位的不同可分为动脉血栓和静脉血栓，以动脉血栓最为常见。作为中枢器官，脑参与完成机体各种生命活动，丰富的能量需求使得脑部血供系统复杂且脆弱，脑部血管易产生血栓而堵塞，导致周围脑组织血供不足，引发缺血缺氧性变性及坏死，继而影响脑的正常生理功能[2]。因此目前缺血性脑卒中的临床治疗多从血栓入手，主要采用溶栓和抗凝两种方法，同时以支架置入术为主的介入治疗也迅速发展，该病治愈率有所提高[3]。然而抗血小板治疗抵抗、介入术后的再灌注损伤、抗凝药物引起脑出血等问题依旧严重，探寻更为有效的治疗方法成为相关医务工作者的首要任务[4-5]。

中医药作为中华民族的传统瑰宝，其“辨证论治”的思想对于多种疾病的治疗具有重要的指导意义。对于缺血性脑卒中，中医学者从气血运行理论出发，确立了活血化瘀为主，益气补血相辅的治疗理念，同时积极研发以心脑康胶囊、脉络宁注射液为主要代表的现代中药剂型，在实际临床应用中取得了相当不错的效果[6-7]，为缺血性脑卒中的治疗提供了更加广阔的思路。

本课题组长期致力于缺血性脑卒中的中医药疗法，通过前期文献调研并结合老中医临床经验确定以蝮蛇、黄芪为君药，天麻、水蛭、丹参为臣药；川芎、鸡血藤、地龙为佐药；麝香为使药的关键复方，以中药细粉配合蜂蜜制得便携式蜜丸，取名正源抗栓蜜丸。其中蝮蛇、水蛭、地龙均属虫药，其药性善走，可祛风通络、除瘀消癥；黄芪、丹参、鸡血藤活血通经、益气补虚；天麻、川芎、麝香消瘀止痛、养血活血。诸药联用，共奏活血化瘀、补虚通络之效。同时现代研究发现水蛭能够作用于纤维蛋白原、纤溶酶原等参与血栓形成的重要分子,调节凝血级联反应和血小板活化[8]，从而实现抗血栓效应；黄芪含有的黄芪总皂苷可增强前列腺环素合成酶活性，抑制血小板聚集；丹参通过抑制血栓素A2合成实现血小板聚集的抑制作用[9]；蝮蛇、天麻、川芎等能够抗氧化应激、保护内皮细胞以及促进血管新生[10-12]。以上发现提示正源抗栓蜜丸具有良好的抗血栓和脑保护作用，能够作为临床治疗缺血性脑卒中的潜力药物。现探究正源抗栓蜜丸对角叉菜胶致小鼠尾部血栓的作用，为其下一步临床应用提供佐证。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性KM小鼠60只，体重为(25±5)g，由大连医科大学SPF动物实验中心提供[动物使用许可证号：SYXK-(辽)2018-0007]

1.2 药品和器械 正源抗栓蜜丸(批号：20191012，规格：0.3 g)；心脑康胶囊(吉林密之康药业有限公司，批准文号：国药准字Z22025480)；L型角叉菜胶(上海津颂实业有限公司)；水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司)；生理盐水(江西科达卫生用品公司)；一次性使用无菌注射器(大连JMS医疗器具有限公司)；游标卡尺(日本三丰仪器)；灌胃针头(北京合力科创科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 分组及给药 将适应性饲养一周的雄性KM小鼠随机分为六组，即空白组、模型组、心脑康胶囊组(6.0 g·kg-1)、正源抗栓蜜丸低剂量组(1.0 g·kg-1)、正源抗栓蜜丸中剂量组(2.0 g·kg-1)和正源抗栓蜜丸高剂量组(4.0 g·kg-1)，每组10只。称重后灌胃相应药物和生理盐水，灌胃体积为1 mL/100 g，每日1次，连续7 d。

2.2 模型制备 依据文献记述[14,17-18]并结合预实验结果制备小鼠尾部血栓模型。第7次灌胃后，除空白组外其余各组小鼠腹腔注射L型角叉菜胶(40 mg·kg-1)并将其尾部浸入0～4 ℃冷水进行低温刺激，1 min后捞出并擦干。

2.3 数值测定 造模24 h后观察小鼠行为变化并以10%水合氯醛(1 mL/300 g)进行麻醉，然后以游标卡尺测量小鼠尾部全长以及血栓长度，同时以组为单位拍摄小鼠尾部血栓照片。数值测定完成后处死小鼠。

3 结果

3.1 小鼠行为状态的变化 空白组小鼠状态如常，模型组小鼠饮食差、活动性弱、畏冷，其余各组小鼠行为状态明显优于模型组，以正源抗栓蜜丸中剂量组小鼠最佳。

3.2 小鼠尾部血栓 造模24 h后，各组小鼠尾部不同程度地出现暗红色血栓，同时部分小鼠尾部血栓干枯脱落形成断尾。如图1所示。

A.模型组；B.心脑康胶囊组；C.正源抗栓蜜丸低剂量组；D.正源抗栓蜜丸中剂量组；E.正源抗栓蜜丸高剂量组图1 小鼠尾部血栓

3.3 小鼠黑尾率、尾部血栓长度和尾部血栓相对长度的比较 与空白组小鼠相比，模型组小鼠黑尾率达100%，尾部血栓约占全尾长度的25%，差异显著(P<0.01)，提示模型制备成功。与模型组小鼠相比，心脑康胶囊组小鼠及正源抗栓蜜丸高剂量组小鼠的黑尾率、尾部血栓长度和尾部血栓相对长度均有所降低，但差异不明显(P>0.05)；正源抗栓蜜丸低、中剂量组小鼠的尾部血栓长度、尾部血栓相对长度以及正源抗栓蜜丸中剂量组小鼠的黑尾率降低，且差异显著(P<0.01或P<0.05)。详见表1。

表1 小鼠黑尾率、尾部血栓长度和尾部血栓相对长度的比较

4 结论

角叉菜胶又名卡拉胶、鹿角菜胶，属于多糖混合物，广泛应用于医疗、食品、化工等诸多领域，分为K型 (Kappa) 、I型 (Iota) 、L型 (Lambda)三种，能够刺激机体释放以IL-1β为主的多种炎性因子，损伤血管内皮的同时激活凝血酶、活化血小板，使血小板与受损的内皮细胞相互黏附，形成血小板小梁。而受损的内皮细胞产生的凝血因子诱发凝血级联反应，使得血流速度减缓，大量红细胞吸附在血小板小梁上，从而形成血栓[13]。角叉菜胶致小鼠尾部血栓之法乃胡三觉教授等[14]自国外引入，相较于创伤性手术造栓，该法操作简便、成本低廉、人为因素干扰少、尾部血栓的形成十分直观，该方法已在抗血栓类药物的功效研究方面得到广泛应用[15-16]。刘彦霞等[17]发现相较于皮下注射，腹腔注射能够显著提高小鼠尾部出栓率和出栓速度，同时剂量、温度、湿度等因素对于小鼠尾部出栓具有一定影响；张俊林等[18]认为同等条件下雄鼠较雌鼠更易出栓，L型角叉菜胶较I型出栓率更高且血栓相对长度更长。故本课题组以雄性KM小鼠和L型角叉菜胶作为实验基本材料，通过腹腔注射造模，同时控制实验温度为(15±5)℃，湿度为20%，以保证小鼠的出栓率，为探究正源抗栓蜜丸对小鼠尾部血栓作用提供基础。

小鼠尾部仅腹侧一条尾动脉,左右两侧以及背侧血管均为静脉，属于典型的单动脉供血，正常情况下血液沿尾动脉从尾根向尾梢流动，在流动过程中与周围组织细胞不断进行物质交换以保证能量供应，然后通过三条静脉实现血液回流。小鼠腹腔注射角叉菜胶后，在炎性因子的刺激下发生血管内皮的损伤，小鼠尾梢部分在24 h内形成暗红色血栓并不断向尾根部延伸，由于缺少侧枝循环，血栓形成区域逐渐变性坏死并干枯脱落，形成断尾。与小鼠尾部血栓的发展相似，缺血性脑卒中病变后期由于长期的缺血缺氧，脑组织氧化应激明显，并逐渐变性坏死，造成不可逆性病理损伤，使脑丧失正常生理功能，甚至于脑死亡[2,19]，同时脑部血栓的长度与缺血性脑卒中的严重程度具有明显的正相关性。由此可见，小鼠尾部出栓率和血栓长度的变化不但可以直接体现正源抗栓蜜丸的抑制血栓作用，而且在一定程度上能够说明正源抗栓蜜丸对于缺血性脑卒中的潜在疗效。因此，在该研究中我们以小鼠黑尾率、小鼠尾部血栓长度以及小鼠尾部血栓相对长度作为关键指标，通过对比不同组别间上述指标的差异以确定正源抗栓蜜丸对于角叉菜胶致小鼠尾部血栓的作用，进而说明正源抗栓蜜丸治疗缺血性脑卒中的潜能，这也与其他学者的研究相一致[12,15-16,20-21]。

实验结果显示，低、中剂量正源抗栓蜜丸均能显著抑制小鼠尾部血栓形成，以中剂量效果最佳；同时高剂量正源抗栓蜜丸对小鼠尾部血栓形成的抑制作用反而不及低剂量有效，甚至与模型组无明显差异(P>0.05)。我们认为可能是由于高剂量组小鼠的实际药物摄入量较低剂量组更低。例如，过高浓度药物的摄入刺激小鼠的胃部神经，使其反射性呕吐，导致实际药物摄入量降低。但我们在实际操作中并没有明显地观察到这一现象。另一方面，这一反常现象可能与药物自身特性有关，实验中高剂量正源抗栓蜜丸药物浓度可能位于倒“U”型浓度-作用曲线最适浓度的右侧，与最适浓度间的距离甚至大于低剂量正源抗栓蜜丸，所以其抑制小鼠尾部血栓形成的效果不佳；再者，也可能是高浓度药物抑制了小鼠对药物本身的吸收或者促进其排泄。

综上所述，一定浓度的正源抗栓蜜丸能够明显降低小鼠黑尾率、尾部血栓长度以及尾部血栓相对长度，显著抑制角叉菜胶致小鼠尾部血栓。鉴于正源抗栓蜜丸组分的物质基础研究[8-12]以及角叉菜胶致小鼠尾部血栓与缺血性脑卒中发病的相似性，我们认为正源抗栓蜜丸具有治疗缺血性脑卒中的潜能，但具体疗效如何，有待后续进一步探讨。