植物WRKY转录因子研究进展

孙 超，王翠香，梁 燕，李春明，张兆云，矫兴杰，韩传明*

（1.山东省林业科学研究院，山东济南250014；2.国家林业和草原局华东核桃工程技术研究中心，山东济南250014；3.海阳市森林资源监测保护服务中心，山东海阳265100；4.烟台市牟平山省级自然保护区管理中心，山东烟台264100）

转录因子的调控是维持细胞基因调控完整性的基本步骤，它们在植物生长发育、抵御生物胁迫和非生物胁迫中起着至关重要的作用[1，2，3]。1994年，第一个WRKY转录因子成员SPF1（Sweet-Potato-Factor-1）从甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出来[4]。此后，大量的WRKY 家族成员在几十种植物中被相继发现，其中，拟南芥中含有72 个成员[5]，水稻中有102 个成员[6，7]，大豆中有197 个[8]，棉花中有116 个[9]，油菜中有46 个[10]，黄瓜中有55 个[11]，苹果中有116个[12]，石榴中有69 个[13]，番茄中有81 个[14]，杨树中有104 个[15]，巨桉中有79 个[16]，橡胶树中有81 个[17]，苜蓿中有29 个[18]。

本文将对WRKY转录因子的结构和分类、在植物生长发育、对生物胁迫和非生物胁迫响应防御等过程中发挥的调控功能进行阐述，为全面研究WRKY转录因子家族的调控和深入剖析每个成员的作用机理提供思路。

1 WRKY转录因子的结构与分类

WRKY转录因子最显著的特征是含有高度保守的60 个氨基酸构成的WRKY 结构域，该结构域的N 末端有保守的WRKYGQK 七肽序列，C 末端有Cys(2)-His(2)型或Cys(2)-HisCys 型锌指结构。七肽序列的数量和锌指结构的类型决定了WRKY转录因子结合靶基因启动子顺式元件W-box（TTGACC/T）的亲和能力，也是WRKY转录因子家族分类的依据[19，20]。WRKY转录因子分为3 类。第Ⅰ类含有两个WRKYGQK 序列，第Ⅱ类和第Ⅲ类含有一个WRKYGQK 序列。第Ⅰ类和第Ⅱ类具有相同的锌指结构，为C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，第Ⅲ类的锌指结构C-X7-C-X23-H-X1-C。依据氨基酸序列的差异，第Ⅱ类又可以进一步细分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe5 个亚类。拟南芥的72 个WRKY转录因子中，第Ⅰ类有32 个，第Ⅱ类有26 个，第Ⅲ类有14 个。石榴WRKY转录因子家族的69 个成员中，第Ⅰ类有14 个成员，第Ⅱ类有45 个成员，第Ⅲ类有10个成员。

2 WRKY转录因子在植物生长发育中的作用

GA 是一类重要的激素，参与了植物种子萌发、营养生长、开花等过程。对水稻基因组序列分析得到的77 个WRKY 基因进行鉴定发现，OsWRKY71在糊粉层细胞中高表达并且GFP：OsWRKY71 被定位于糊粉层细胞核。GA 信号可诱导转录激活因子OsGAMYB 的表达，同时，OsGAMYB 可激活α-淀粉酶基因Amy32b 的表达。进一步研究发现，OsWRKY71 通过与Amy32b 启动子上W-box 的结合，阻断了OsGAMYB 对Amy32b 的激活。在水稻糊粉层细胞中，OsWRKY71 是GA 信号的转录抑制因子[21]。WRKY 蛋白WRKY18、WRKY40 和WRKY60通过与ABA 受体结合，作为ABA 信号负调控因子在拟南芥种子萌发和生长过程中起作用[22]。

褪绿是叶片衰老过程中可见的部分。叶绿素和光合反应器的分解使叶片呈现浅绿色或淡黄色。当叶片出现这些迹象时，衰老程序早已在分子水平上启动了。在多种植物中的研究证明了WRKY转录因子广泛参与了植物的衰老过程，其中WRKY53 与H2O2、ROS（reactive oxygen species）、细胞内Ca2+水平、ABA、JA 等相关联，被证明是植物衰老调控网络的中心之一[23]。转棉花GhWRKY22 基因的拟南芥植株表现出雄性不育，花粉粒数量较野生型减少。与野生型相比，过量表达GhWRKY22 的转基因拟南芥植株中JA 生物合成相关基因的表达上调，而JA抑制因子JAZ1 和JAZ8 的表达下调。酵母单杂交和芯片qPCR 分析表明GhWRKY22 通过直接结合JAZ 基因的启动子来调控花药/花粉发育[24]。

3 WRKY转录因子在植物生物胁迫中的作用

植物的生物胁迫主要包括病原体、病原相关分子模式（PAMPs，Pathogen -associated molecular patterns）、激发子等。通常情况下，胁迫信号的感知是通过膜结合或可溶性受体或激活植物激素依赖过程来。在拟南芥中，由PROPEP 基因编码的受体激酶PEPR1 和PEPR2，可感知植物损伤相关的分子模式，以增强防御反应。WRKY33 以依赖激活的方式与2 个受体激酶基因的启动子结合并调节它们的表达[25]。烟草花叶病毒（TMV）和SA 都能诱导烟草tWRKY3 和tWRKY4 的表达；大豆细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv.glycinea）、SA、MeJA 等都能诱导编码WRKY转录因子基因NtEIG-D48 的表达。这说明WRKY转录因子通过调控不同防御基因的表达，参与了烟草多个防御途径[26]。在拟南芥叶片细胞的PAMP 防御中发现，细菌或真菌病原体都可以启动AtWRKY22 和AtWRKY29 结合FLS2 起作用的防御途径[27]。玫瑰56 个编码WRKY转录因子的基因中，有19 个基因受灰霉菌（Botrytis cinerea）诱导表达。通过VIGS（virus-induced gene silencing）的方法将花瓣中RcWRKY41 基因沉默，接种灰霉菌后发现：与对照相比，RcWRKY41 基因沉默花瓣的病斑明显增大，表现出更严重的病症[28]。通过对斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）进食前后的拟南芥转录组分析发现，食草行为导致拟南芥WRKY18 和WRKY40 在内的42 个转录因子诱导表达，这也暗示着WRKY18 和WRKY40 在抵御斜纹夜蛾进食行为对植物造成的伤害中起着重要的作用[29]。

4 WRKY转录因子在植物非生物胁迫中的作用

植物的非生物胁迫主要包括高温、低温、干旱、盐害、机械损伤、缺素、渗透等。WRKY转录因子通过复杂的信号转导途径参与植物的非生物胁迫响应，并发挥了重要的调控作用。一个WRKY 蛋白通常参与多个胁迫响应的调控，有些甚至能同时在生物胁迫和非生物胁迫中起作用。近年来，人们基于WRKY 基因的过量表达和敲除、基因组和转录组分析、基因芯片分析、实时荧光定量PCR 等方法和技术，分析和鉴定了多种植物中WRKY转录因子在非生物胁迫下的功能。

4.1 高温和低温胁迫

高温和低温胁迫是主要的非生物胁迫。植物在遭遇高温或低温胁迫时，WRKY转录因子通过调控下游相关基因的表达，帮助植物抵抗温度的为害。TaWRKY1 和TaWRKY33 基因的启动子中含有多个非生物胁迫相关的顺式作用元件。TaWRKY1 在高温或ABA 诱导下微弱上调，在低温诱导时下调；TaWRKY33 在高温、低温、ABA 或MeJA 的诱导下都高表达。TaWRKY1 和TaWRKY33 基因的过量表达都能激活下游胁迫相关基因的表达，转基因拟南芥在多种胁迫下的发芽率和根生长量均高于对照。脱水处理时，转TaWRKY33 基因拟南芥株系比转TaWRKY1 基因拟南芥株系和对照表现出较低的脱水率。更重要的是，转TaWRKY33 基因拟南芥株系耐高温胁迫的能力增强[30]。在高温胁迫下，拟南芥WRKY25 和WRKY26 基因的表达诱导上调，而WRKY33 基因的表达被抑制。与野生型拟南芥相比，3 个单突变体wrky25、wrky26 和wrky33 对热激响应微弱，而双突变体wrky25wrky26、wrky25wrky33和三突变体wrky25wrky26wrky33 对热胁迫的敏感性显著增加，同时表现出种子发芽率降低、存活率下降和电解质外渗升高。WRKY25、WRKY26 和WRKY33 基因的过量表达都能增强转基因植株抵御热激胁迫的抗性。进一步的研究发现，通过正向调节ETH 激活和热激蛋白相关的信号途径，WRKY25、WRKY26 和WRKY33 相互协同地调控着拟南芥对热激胁迫的响应[31]。

植物激素JA 参与了植物多个逆境胁迫的响应，能降低低温胁迫对果实的伤害。香蕉MaWRKY26 基因被低温胁迫和MeJA 诱导表达，并能增强香蕉果实的抗寒性。通过与基因启动子的结合，MaWRKY26 还能反向激活JA 合成基因MaLOX2、MaAOS3 和MaOPR3 的表达，促进JA 的合成从而减轻低温对香蕉果实造成的伤害[32]。茄子SmWRKY26 和SmWRKY32 基因在冷害胁迫下表达上调。通过VIGS 的方法，将这两个基因沉默后，在冷害胁迫下，基因沉默的株系出现严重萎蔫，而对照仅呈现轻微的黄化，同时，基因沉默株系的叶片冷害指数（leaf chilling injury index，LCI）显著高于对照[33]。

4.2 干旱胁迫

干旱是抑制植物生长和限制作物产量最严重的环境因素之一。拟南芥WRKY57 基因启动子TDNA 插入的突变体adt 抗旱能力增强。与野生型拟南芥相比，adt 突变体和WRKY57 基因过量表达拟南芥植株内ABA 含量增加，同时，胁迫相关基因RD29A，ABA3 和NCED3 表达上调。WRKY57 通过调节ABA 的水平和正向调控胁迫相关基因的表达增强了拟南芥的耐旱性[34]。T-DNA 插入突变体abo3（Atwrky63）突变体拟南芥降低了对ABA 的敏感性和耐旱性，进一步的分析发现AtWRKY63 位于ABA 信号传导途径中ABI1、ABI2 和ABI5 的下游，ABF2、RD29A 和COR4 的上游，这说明AtWRKY63可通过调节ABA 的水平参与调控拟南芥的耐旱性[35]。水稻WRKY转录因子OsWRKY30 能与OsMPK3、OsMPK4、OsMPK7、OsMPK14、OsMPK20-4 和OsMPK 20-5 相互结合，并且能被OsMPK3、OsMPK7 和OsMPK14 磷酸化。OsWRKY30 基因的过量表现可显著提高转基因水稻的耐旱性。进一步的研究证明OsWRKY30 在 MAPKs 作用下的磷酸化是OsWRKY30 发挥生物学功能的关键[36]。

杜梨PbrWRKY53 基因被干旱和ABA 诱导大幅上调，但只受到盐害和冷害轻微诱导。PbrWRKY53 基因过量表达的烟草和杜梨植株都增强了对干旱胁迫的耐受性。与对照相比，转基因植株表现出更高的含水率、更少的活性氧含量、更高水平的抗氧化酶活性和代谢产物。此外，与野生型烟草相比，PbrWRKY53 基因在转基因烟草中的过量表达使植株维生素C 含量增加。PbrWRKY53 基因被敲除的杜梨植株中，PbrNCED1 表达量下降，同时，植株对干旱胁迫的耐受性降低。酵母单杂交试验、EMSA 和瞬时表达分析表明，PbrWRKY53 能与PbrNCED1 启动子区的W-box 结合。PbrWRKY53转录因子通过调节PbrNCED1 的表达调控植株的耐旱性和维生素C 的合成[37]。玉米ZmWRKY40 基因的表达能被干旱、盐害、高温和ABA 所诱导，并且在干旱处理1 h 后即达峰值，为处理前表达量的12倍。对ZmWRKY40 基因过量表达的拟南芥分析发现，ZmWRKY40 通过调控胁迫相关基因STZ、DREB2B 和RD29A 表达，提高了POD（过氧化物歧化酶）和CAT（过氧化氢酶）的活性，降低了ROS（活性氧）的含量，从而增强了转基因株系的抗旱性[38]。硬皮豆MuWRKY3 基因在干旱胁迫下极高表达。将MuWRKY3 基因转入花生中进一步研究发现，与对照相比，转基因株系在干旱胁迫处理后萎蔫症状较轻，并且症状出现得更晚。在干旱胁迫下，与胁迫相关的LEA、HSP、MIPS、APX、SOD 和CAT 基因在转基因花生中表达上调，转基因花生植株体内丙二醛、过氧化氢和超氧阴离子积累较少，游离脯氨酸、可溶性总糖含量和抗氧化酶活性较高[39]。

4.3 盐害胁迫

盐害胁迫不同程度地抑制了植物的营养生长和生殖生长，对植物造成原初盐害和次生盐害，破坏植物正常的形态结构，严重时植物甚至干枯死亡。拟南芥WRKY25 和WRKY33 基因的表达受NaCl 诱导上调，并且WRKY25 和WRKY33 基因的过量表达，能都增强转基因植株对NaCl 的抗性[40]。葡萄VvWRKY30 基因的表达受盐胁迫的诱导。将VvWRKY30 基因过量表达，盐胁迫下的转基因拟南芥株系中与抗氧化生物合成、糖代谢和脯氨酸生物合成相关的基因表达上调，同时具有较低的活性氧含量、较高的抗氧化活性、可溶性糖和脯氨酸浓度[41]。番茄SlWRKY8 基因的表达受番茄细菌性叶斑病病原（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，Pst.DC3000）、干旱、盐害、冷害、ABA、SA 的诱导上调。在盐害胁迫下，SlWRKY8 基因过量表达的植株相较于对照植株仅表现轻微的萎蔫，同时，脯氨酸等渗透物质含量更高，胁迫应答基因SlAREB、SlDREB2A 和SlRD29 的表达上调[42]。酵母单杂交和瞬时共转染试验表明，苦荞FtWRKY46 基因能与W-box 结合并激活报告基因的表达。在盐害胁迫下，转FtWRKY46 基因拟南芥的种子发芽率、根长、叶绿素含量、脯氨酸含量显著高于对照，但MDA 含量显著低于对照[43]。

4.4 其它非生物胁迫

利用拟南芥单突变体wrky54、wrky70，双突变体wrky54wrky70 和WRKY70 过量表达的转基因拟南芥进行渗透胁迫（聚乙二醇）研究发现，wrky54wrky70 双突变体对渗透胁迫的耐受性明显增强，同时，起渗透保护作用的脯氨酸积累减少，渗透胁迫反应基因的表达下调。渗透胁迫处理后，wrky54wrky70 双突变体的失水率和气孔导度比野生型要低。表明WRKY70 和WRKY54 共同作为气孔关闭的负调节因子，影响了拟南芥的渗透胁迫耐受性[44]。在不同浓度低磷胁迫处理下，马尾松PmWRKY11、PmWRKY12 和PmWRKY13 基因表达都上调[45]。过量表达OsWRKY74 基因显著增强了水稻对磷饥饿（Pi starvation）的耐受性，而OsWRKY74基因下调的转基因植株对磷饥饿敏感。在磷饥饿条件下，与野生型相比，过量表达OsWRKY74 基因的水稻植株根生物量、茎生物量、磷浓度、分蘖数、粒重不同程度地增加了，同时表现出更强的磷饥饿耐受性[46]。WRKY25 基因过量表达延长了转基因拟南芥的生命周期，而敲除WRKY25 基因则加快了植株的衰老。与野生型拟南芥相比，WRKY25 基因过量表达植株表现出更低的H2O2含量和更强的氧化胁迫耐受性，wrky25 突变体的表现与WRKY25 基因过量表达植株恰恰相反[47]。

5 展望

WRKYs 是植物中最大的转录因子家族之一，参与了植物生物胁迫和非生物胁迫响应和植物生长发育的调控并发挥着关键的作用。近年来，对WRKY 在上述方面的研究取得了一定的进展，但是由于WRKY 家族成员众多和参与调控的各种途径相互交织，对WRKY转录因子家族各成员功能的冗余和差异，自我反馈调节机制和信号转导途径间的调控机理尚不清楚，仍需在深入持久研究的基础上加以证实和完善。