牛羊瘤胃微生物多样性及其影响因素

司丽炜， 韩红燕

（省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古大学，内蒙古呼和浩特010070）

1 反刍动物瘤胃微生物多样性

在健康的反刍动物瘤胃内栖息着复杂、多样、非致病的多种微生物，其中包括瘤胃细菌、厌氧真菌、古细菌及瘤胃原虫等。根据微生物的定植部位可分为三类：瘤胃液相菌、瘤胃固相菌和瘤胃壁黏附菌（代文婷，2014）。

1.1 瘤胃细菌 反刍动物瘤胃微生物中细菌的数量和种类最多，瘤胃液中细菌数量为1010～1011cfu/mL（巴哈提古丽，2010）。根据形态瘤胃液中细菌大致可分为球菌、短杆菌、长杆菌、弧菌和螺旋菌等；根据功能可分为纤维素降解细菌、半纤维素降解细菌、淀粉降解细菌、蛋白降解细菌、脂肪降解细菌、利用酸菌和乳酸产生菌等。Jami等（2013）观测以色列荷斯坦奶牛从出生到成年期间瘤胃菌群的变化发现，1～3日龄组中厚壁菌门较其他年龄组更为丰富，而在2月龄组群中其数量有所减少，并在6月龄时再次明显地增加，表明厚壁菌门受月龄影响显著。1～3日龄组拟杆菌门显著低于其他月龄组群，但在更大的年龄族群中变成最丰富的门类。另外有研究表明，黄色瘤胃球菌在1日龄的犊牛瘤胃中可以检测到，在3日龄犊牛瘤胃中的数量大幅增加，而白色瘤胃球菌（R.albus）在3日龄犊牛瘤胃中首次出现。另一种水解纤维素菌，珀酸丝状杆菌只有到2月龄大犊牛瘤胃中才能检测得到。在相对丰富度高的1～3日龄犊牛瘤胃样本中发现有可以利用淀粉和发酵乳糖的牛链球菌。瘤胃主要的蛋白降解菌包括嗜淀粉瘤胃杆菌（Bacteroides amylophilus）、栖瘤胃普雷沃斯菌（Prevotellaruminicola）、溶纤维丁酸弧菌 （Butyrivibriofibrisolvens）和牛链球菌（Streptococcus bovis）（Attwood 和 Reilly，1995）。

1.2 瘤胃真菌 自Orpin等（1975）发现反刍动物瘤胃内存在厌氧真菌后，迄今为止已发现瘤胃真菌的数量至少占瘤胃微生物总数量的8%，数量可达106个/mL。这些真菌严格厌氧，体外培养非常困难，因而目前对这些真菌功能的了解有限。分子生物学手段被用来鉴定真菌，最开始采用的是18S rDNA技术，其被用来鉴定真菌以及对真菌分类，不久该技术被内转录间隔区（ITS）所取代，但由于ITS区域极高的AT区域以及内部本身的变异，使得ITS被认为用来鉴定真菌的技术不成熟（Zhang等，2017）。瘤胃真菌的作用也是近些年研究热点。有研究表明，瘤胃真菌不仅可以以机械方式通过假根刺穿植物细胞壁，而且可以分泌高活性纤维素酶、半纤维素酶等多种酶，以化学方式作用于一些难降解的植物组织，如坚固的后壁组织和维管束组织等（Kumar，2013）。刘起丽等（2014）为了筛选新的降解玉米秸秆的高产纤维素酶真菌，通过常规分离、纤维素刚果红培养基培养、测定滤纸酶活和羧甲基纤维素（CMC）酶活等一系列方法，获得了一株高产纤维素酶的真菌MC-1。pH降低对瘤胃真菌的生长有抑制作用，尽管有些瘤胃真菌有降解纤维的作用，但有关其对瘤胃酸中毒的影响鲜见报道。Joblin等（1990）研究表明，真菌的丰度和水解潜能可增加例如甲烷古细菌这种氢利用物种的数量。

1.3 瘤胃古细菌 目前所知的瘤胃内古细菌主要分为广古菌门（Euryachaeota）和泉古菌门（Crenarchaeota）两种类型，包括甲酸甲烷杆菌、普雷沃氏菌、反刍兽甲烷短杆菌、甲烷短杆菌属、可活动甲烷微菌、甲烷八叠球菌属、甲烷囊菌属7种。甲烷菌为严格厌氧菌，属于广古菌门，瘤胃中主要为甲烷古菌。甲烷古菌的数量为107～109cfu/mL，其数量的变化很大程度上取决于日粮类型。产生甲烷的过程是一个能量损失的过程，甲烷能占总能的8%左右。胃肠道甲烷排放主要来自于瘤胃（87%～90%），其余来自大肠（10%～13%）。对动物营养学者和畜禽生产者来说，胃肠道甲烷的排放是对饲料资源的一种浪费，甲烷排放量大小是饲料瘤胃发酵能量损失的主要标志。因此，控制胃肠道甲烷排放具有经济和环境两方面的意义（孙凯佳，2015）。

1.4 瘤胃原虫 瘤胃原虫是反刍动物瘤胃微生物的主要类群之一，数量（105～106cfu/mL）虽然少于其他种类，但由于其体积大，在瘤胃微生态总量中占相当大的比例，约占瘤胃内50%的生物量。原虫在瘤胃内直接影响饲料中碳水化合物、含氮物质、矿物质和维生素的消化和利用（Koenig，2000）。纤毛原虫与产甲烷菌联系紧密，通过消除纤毛原虫可降低9%～40%甲烷的排放。此外，纤毛原虫对瘤胃细菌和真菌均有利，其可清除氧气，调节微生物区系，同时将微生物氮传递给宿主 （赵向辉，2012）。Zhang等（2017）总结了原虫对酸性洗涤纤维消化率的影响，认为在原虫存在的条件下，植物细胞壁消化率可提高15%左右。原虫可降解纤维总量的25%～30%，但其主要发酵底物是淀粉和可溶性糖类，是影响瘤胃微生物多样性的因素。

2 影响反刍动物瘤胃菌群的因素

2.1 日粮对反刍动物瘤胃菌群的影响 饲料是影响瘤胃微生物的主要因素，其中影响最大的是碳水化合物。赵向辉（2012）研究发现，增加日粮中代替淀粉的中性洗涤可溶性纤维含量，会降低R.albus和R.flavefaciens数量；单纯提高中性洗涤纤维供应量会增加R.flavefaciens的拷贝数 （P＜0.02），同时降低 R.albus拷贝数（P ＜ 0.01）。 而补加蔗糖提高了瘤胃液相R.albus拷贝数 （P=0.01），但不影响固相纤维分解菌菌群；日粮中添加果胶，瘤胃液相和固相部分的R.albus 16S rDNA拷贝数分别高于 （P＜0.01）和趋向于 （P=0.10）高于添加淀粉组，在低日粮瘤胃降解蛋白下，蔗糖组固相R.flavefaciens拷贝数趋向于（P=0.06）低于淀粉组。日粮中非纤维性碳水化合物与中性洗涤纤维比值增加，瘤胃发酵从乙酸型发酵转向丙酸型发酵；同时，瘤胃微生物区系组成发生改变，瘤胃细菌总量下降（Zhang，2017）。

Kim等（2014）研究表明，蛋白质水平从124 g/kg升高至219 g/kg，细菌总数显著增加 （P＜0.05），真菌和原虫数量没有显著改变；豆科植物是很好的蛋白质补充剂，水牛日粮中补充豆科植物能够增加瘤胃微生物数量，尤其是黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌 （Chanthakhoun和Wanapat，2010）。另外，不同的粗蛋白质水平下蛋白降解菌、淀粉分解菌、纤维分解菌差异不显著 （P＞0.05）（Chanthakhoun，2012）。

2.2 日龄对瘤胃菌群的影响 日龄也是影响宿主瘤 胃 微 生 物 组 成 的 因 素 之 一 （Rey，2014；Jami，2013）。刚出生时瘤胃发育并不完全，伴随食物的摄入和接触环境微生物，瘤胃功能逐渐发育完全。随着年龄的增长，瘤胃微生物群落多样性和丰度指数变高。但有研究表明，在犊牛7日龄时已经在瘤胃内发现了常见于成熟瘤胃中的古菌、细菌和真菌，表明瘤胃菌群的形成与饲料摄入无关（Dias，2017）。饮食干预幼年山羊（从出生到3月龄）可改变断奶后瘤胃微生物的组成，并影响宿主的表型（甲烷排放，挥发性脂肪酸生产）（Abecia，2014）。 饮食干预使幼年山羊瘤胃原虫的生长受到抑制，在成熟后其所占的比例也发生了改变（Morgavi，2015）。这些研究表明，反刍前阶段微生物区系的变化可能会影响成熟后微生物的演替和宿主表型。

断奶年龄是影响瘤胃微生态组成的关键因素。拟杆菌门和厚壁菌门分别是断奶前后犊牛瘤胃最丰富的门类（Meale，2017）。当饲喂代乳粉后，6周龄犊牛与2周龄相比较，瘤胃拟杆菌门和普氏菌属相对丰度指数变高，而厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门相对丰度指数变低;与饲喂以干草为主日粮的12月龄牛相比，后者瘤胃普氏菌属相对丰度更高；与饲喂混合饲料哺乳母牛相比，普氏菌属相对丰度前者更高，但拟杆菌属较低。对比突然被断奶犊牛与逐渐断奶犊牛瘤胃液菌群发现，逐级断奶有利于犊牛肠胃适应能力的提高（Steele，2017）。刚断奶犊牛（6周龄）瘤胃菌群的β多样性变化迅速，而在完全断奶犊牛（8周龄）瘤胃菌群变化更为缓慢。结合更早的研究发现，犊牛开始使用固体饲料越早，越有利于瘤胃发育成熟并建立更稳定的微生物群落，然而，有一些菌种不能适应断奶时肠胃复杂的变化，为了探究这些菌种功能，需要结合断奶后瘤胃的功能，调整断奶时间以及代乳品比例。

2.3 品种对瘤胃菌群的影响 一些研究表明，品种对瘤胃微生物的影响不明显，虽然不同动物细菌群落组成存在差异，但在门或种属水平上细菌群落组成与品种没有明显相关性，古细菌群落也与品种没有明显相关性（Lin，2015）。 Rira 等（2016）对比Texel和Blackbelly羊发现，品种对瘤胃微生物影响较小。韩帅等（2015）通过对比呼伦贝尔羔羊与杂交一代羔羊，得到品种对羔羊的瘤胃氨基酸合成微生物无显著的影响。徐琴等（2015）通过对比波杂山羊和南江黄羊发现，品种差异对绝大部分的微生物没有产生影响。Henderson等（2016）从32种动物的研究中发现，在所有样品中，占主导地位的细菌和古细菌品种相似，只有少数几个主要的细菌与品种相关联。例如，未分类的Veillonellaceae在羊、鹿和骆驼的比例更大。这可能与牛的瘤胃和骆驼的前肠尺寸、解剖和进食频率的差异有关。古细菌群落具有多样性，产甲烷的古细菌高度保守。

另有些研究则表明，品种对瘤胃细菌群落组成影响很大。刘开朗等（2009）构建了1个鲁西肉牛瘤胃细菌16S rDNA文库，并从公共数据库中搜集来自荷斯坦奶牛、晋南牛、牦牛、黄牛和Hanwoo的9个16S rDNA文库，对序列多样性和文库组成等进行了比较分析。结果表明，牛的品种是影响瘤胃微生物群落组成的重要因素，其影响大于日粮或其他因素。万丹（2015）通过比对三品杂奶水牛、尼里-拉菲水牛和摩拉水牛发现，三品杂奶水牛瘤胃液纤维素分解菌含量较高，其对纤维分解吸收能力强于摩拉和尼里-拉菲，摩拉奶水牛瘤胃液原虫占比显著高于尼里-拉菲（P＜0.05），相对于三品杂奶牛有提高趋势，而三品杂奶牛除甲烷菌外的细菌相对于摩拉水平均有提高趋势。摩拉的反刍兽新月型单胞菌、溶纤维丁酸弧菌、白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌相对于其他两个品种均有降低趋势（P＞0.05），这可能是由于原虫能够不断吞噬细菌，影响瘤胃发酵。Adeyosoye等（2014）研究发现，品种不同对于瘤胃微生物发酵初期阶段的瘤胃细菌和真菌的数量、发生率和种类有显著影响。Zhang等（2017）通过分析摩拉水牛和中国荷斯坦牛瘤胃合成氨基酸微生物，揭示了品种与氨基酸微生物生物合成之间有显著相关性。HA Paz等（2016）根据荷斯坦牛牛奶产量高，娟珊牛的牛奶蛋白质和脂肪含量较高等特点，对比两种牛瘤胃微生物群落，发现两种牛瘤胃水解纤维素细菌有明显不同。另有研究发现，荷斯坦牛瘤胃真菌数多于水牛，而水牛中潜在的真菌和全瘤胃微生物多于荷斯坦牛（Shakarami，2015）。综上所述，在日粮、宿主健康、环境温湿度相同条件下，品种也会影响瘤胃微生物群落组成和数量。

2.4 环境对瘤胃菌群的影响 内环境对瘤胃微生态的影响很显著，而外界环境的改变也影响着瘤胃微生态结构的变化。季节变化和饲养方式的改变是影响瘤胃微生态两种重要的外界因素。淡瑞芳等（2006）研究表明，夏季瘤胃内细菌和产甲烷菌数量明显高于其他三个季节；瘤胃真菌数量在春季高于其他三个季节；而瘤胃琥珀酸丝状杆菌数量低于其他三季。不同季节产甲烷菌数量变化较大，夏天瘤胃可培养微生物显著高于冬天。因为春季草地上生物量很容易因风和暴风雪破坏而受到损失，瘤胃细菌在春季数量最低。冬季寒冷影响采食量，进而影响瘤胃微生物数量以及活性。王月等（2006）研究表明，三种类型内蒙古白绒山羊中，阿拉善白绒山羊瘤胃产甲烷菌的平均数量最多，二狼山型次之，阿尔己斯羊最低。所有品种的瘤胃内产甲烷菌和原虫的平均数量均表现为夏季大于冬季。而从品种间差异来看，原虫数量与季节无关，均是阿拉善羊最多。Rira等（2016）通过分别比对在温带与热带环境、C3碳固定饲料与C4碳固定饲料、特塞尔绵羊与黑莓绵羊三种不同因素条件下绵羊瘤胃细菌和甲烷菌基因拷贝数，结果表明，热带地区绵羊水解纤维素细菌基因拷贝数较高，R.flavefaciens和R.albus基因拷贝数差异不明显，瘤胃微生物主要受环境（温带与热带）的影响，饲料类型和品种影响次之。以上的研究结果表明，环境因素可影响牛羊等反刍动物消化道微生态分布。

2.5 微生物添加剂对瘤胃菌群的影响 微生物制剂是指根据微生态学原理从动物或自然界分离、鉴定或通过生物工程合成的有益微生物，经过特殊工艺而制成含有大量有益菌的活菌制剂。有的还含有其代谢产物或（和）添加有益的生长促进因子，用于调节动物机体微生态平衡，增强动物对肠内有害微生物的抑制作用或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进动物生长，提高生产性能或提高饲料转化率的一类药物或饲料添加剂。Kawakami等（2010）通过给刚出生的荷斯坦小牛饲喂添加Lactobacillus plantarum Chikuso-1和Candida sp.CO119两种益生菌饲料，发现小牛瘤胃中乳酸菌含量以及乳酸菌对梭菌属的比值显著提高，并有效抑制腹泻。

徐海燕等（2017）采用三代测序技术测定奶牛粪便样品16S rRNA基因序列全长发现，复合益生菌制剂（Lactobacillus casei Zhang和Lactobacillus plantarum P-8）的补充，虽然没有显著改变奶牛肠道菌群的丰度和多样性，但一些有益细菌（Faecalibacteriumprausnitzii）和大部分瘤胃发酵细菌（Bacterpodes，Roseburia，Ruminococcus，Clostridium，Coprococcus和Dorea）含量显著高于对照组，而一些机会致病菌如Bacillus cereus，Cronobactersakazakii和Alkaliphilusoremlandii明显低于对照组。Haddad等（2005）观察发现，给羔羊饲料添加酵母培养物相对对照组有更高的日增重。益生素能增加羔羊体重，可能由于其可增强微生物蛋白质合成从而产生更多过瘤胃氨基酸。单达聪等（2008）以小尾寒羊早期断奶羔羊为试验样本，以酵母菌和枯草芽孢杆菌作为益生菌添加于饲料中，结果表明，育肥前期日增重提高14.9%。综上所述，在基础日粮中添加微生物添加剂可以帮助提高反刍动物生长性能和饲料利用率。

2.6 植物提取物对瘤胃菌群的影响 植物提取物虽然在草食动物日粮中只占微小比例，但其含有的化学活性物质在改善瘤胃发酵，提高反刍动物生产性能方面发挥着重要作用，如茶皂素通过与瘤胃原虫隔膜表面胆固醇复合，使其无法修复或脱落，从而杀死或破坏瘤胃原虫（Wallace，2002）。植物提取物如皂苷、单宁、香精油等作为瘤胃调控剂主要是通过改变瘤胃微生物的组成和数量来调控瘤胃发酵。Hu等（2005）的体外产气试验研究表明，将8 mg茶皂素添加到30 mL发酵液中，瘤胃原虫数量可减少79%。叶均安等（2001）发现，在体外培养底物中分别添加0.25%、0.50%和1.00%茶皂素，瘤胃原虫生长受到不同程度地抑制，瘤胃发酵状况得到改善。Diaz等（1993）在绵羊日粮（315 g/只）中分别添加25 g和50 g的植物皂素，结果发现与对照组相比，原虫数量分别降低了57%和84%，同时细菌和真菌的数量明显增多。另有体外研究发现，在瘤胃液中添加茶皂苷，真菌数量降低，细菌数量变化较小。而体内试验研究表明，在绵羊日粮中添加3 g茶皂苷，饲养21 d和72 d后，检测发现其瘤胃真菌和细菌数量均减少（王丹丹，2012）。 Goel等（2008）利用 Real-time PCR分析发现，葫芦巴籽皂苷和田菁皂苷可使产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）的数量分别提高42%和45%，而飞廉属植物皂苷和葫芦巴籽皂苷可使黄色瘤胃球菌（Ruminococcusfalve faciens）的数量提高40%。核酸杂交分析表明，毛瓣无患子的甲醇提取物皂苷浓度小于1 mg/mL时，白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌不受其影响，但是当其浓度达到2～4 mg/mL时，二者数量都显著降低。Wina等（2005）研究证明，短时间内毛瓣无患子皂苷能够抑制白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和壶菌纲菌（Chytridiomycetes），而 105 d 后，白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌均不受影响。

单宁能够抑制瘤胃微生物的生长，尤其对瘤胃蛋白降解菌影响显著。单宁抑制细菌是由于单宁与细菌细胞壁及细胞膜形成复合物，导致细胞壁遭到破坏及分泌胞外酶（Wina，2006）。Jones等（1994）研究指出，红豆草单宁能够抑制蛋白降解菌的生长，但对栖瘤胃普雷沃氏菌（P.ruminicola）的影响不大。Tan等（2011）利用微生物学方法和Real-time PCR分析发现，随着浓缩单宁添加水平的增加，产甲烷菌数量呈线性递减趋势 （P＜0.01）。 Bhatta等（2009）报道，添加水解单宁，可减少平均11.6%的产甲烷菌数量，添加水解单宁和缩合单宁混合物却能使产甲烷菌减少28.6%。金龙（2011）通过检测紫色达利菊缩合单宁对秋季放牧安格斯肉牛粪样瘤胃微生物残留的影响发现，在粪便样品中，对照组产琥珀酸丝状杆菌以及瘤胃白色球菌略低于试验组，而非纤维菌反刍动物半月型单胞菌略高于试验组。

3 瘤胃菌群改变对宿主健康的影响

消化道菌群的多样性对宿主的健康有着十分重要的影响。以健康奶牛与患乳房炎奶牛为对象，对肠道菌群中常见的菌属与菌种进行定量研究，试验发现，健康的肠道菌群结构对于保持奶牛的健康状态有直接的影响。瘤胃酸中毒是肉牛常见的瘤胃消化紊乱现象，可导致牛的性能显著降低。瘤胃酸中毒或瘤胃内有机酸积累的增加反映了微生物产生、微生物利用和有机酸瘤胃吸收之间的不平衡，并且纤毛原虫的数量显著降低（Nagaraja，2007）。亚急性酸中毒会引起宿主干物质的摄入、产奶量、盈利能力减少，增加宿主扑杀率和死亡损失。亚急性瘤胃酸中毒会降低瘤胃pH，并显著影响细菌的密度、多样性和群落结构。Mc Cann等（2016）对患亚急性瘤胃酸中毒荷斯坦泌乳奶牛的瘤胃细菌进行10 d跟踪研究发现，随着天数的增加，瘤胃液相内容物细菌中普氏菌、球菌、链球菌以及乳杆菌相对丰度增加，与瘤胃上皮组织细菌相比，瘤胃固相内容物中细菌群落更容易被改变。

4 结论与展望

经过长期的相互选择和适应，微生物和宿主之间形成了一种相互制约、相互依赖的动态平衡。这种平衡对于维持反刍动物的机体健康、减少环境对其污染及保证产品安全、提高反刍动物的生产性能等方面具有重要作用。国内外对反刍动物瘤胃微生态研究主要集中在细菌、甲烷菌和原虫，实际上有些研究中报道真菌和古细菌也发挥着不可代替的作用。尽管很多瘤胃微生物已经得到鉴定，但是大多研究者都将研究方向集中在对微生物群落的多样性研究，而对信号传导机制及品种基因型对瘤胃微生态的影响研究相对较少，是今后重点研究方向之一。