内质网应激在胰岛损伤中作用的研究进展

石 洁 王 宁 赵芯欣 张 锐

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种复杂并具有高发性的慢性代谢疾病。胰岛损伤是DM的主要特征之一，但诱导其发生的作用机制尚未完全阐明。内质网(endoplasmic reticulum，ER)是胰岛素原生物合成的主要场所，对维持胰岛的正常功能发挥着至关重要的作用。近年来研究显示，ER稳态失衡所致的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)与胰岛细胞凋亡以及异常的胰岛素生物合成密切相关。而未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)可以感知ER腔内未折叠/错误折叠蛋白质的压力，并调控ERS相关基因的表达使ER恢复稳态。若UPR持续性发展就意味着ERS未得到缓解，引起ER稳态失衡，最终将会诱导胰岛损伤。因此，调控ERS有可能作为改善胰岛功能的有效靶点，为DM及其并发症的防治提供新的依据。本文主要综述了ERS作为双刃剑，在诱导以及缓解胰岛损伤作用中的研究进展。

一、内质网应激

ER是蛋白质合成、折叠、修饰、转运、钙离子(Ca2+)储存以及脂质生成的主要场所，其对维持细胞内环境稳定发挥着重要的作用。当活性氧(ROS)产生过多、炎性因子释放、ER中Ca2+缺失、高血糖、高血脂时，ER的稳态被破坏，未折叠与错误折叠蛋白质堆积在ER中，诱发的一系列反应叫做ERS[1]。为了应对ERS，细胞启动UPR来恢复ER稳态。UPR是机体感应ERS的主要传感器和调配器，也是在ERS早期的适应性反应。目前认为，UPR主要由3种内质网膜的跨膜蛋白介导：蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、肌醇依赖酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)和活化转录因子6(activating transcription factor-6，ATF6)。

正常生理条件下，3种跨膜蛋白与内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)结合，处于活性抑制状态。而在ERS状态下，内质网跨膜蛋白与GRP78解离，进而促进ERS下游途径被激活。PERK活化后，一方面能使真核翻译起始因子2α (eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，从而抑制蛋白翻译；另一方面也可以选择性地介导转录活化因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的激活，从而诱导内质网应激反应元件(ER stress element，ERSE)的表达。IRE1是一种具有核酸内切酶活性的丝氨酸/苏氨酸激酶。活化的IRE1剪切并编码X盒结合蛋白1(X box-binding protein 1，XBP1)，而剪切的XBP1(spliced X box-binding protein 1，XBP1s)可促进内质网应激相关降解(ER-associated protein degradation，ERAD)途径。ATF6是位于ER膜上的跨膜蛋白，其具有两个亚型ATF6α和ATF6β。与GRP78偶联解除后，ATF6易位到高尔基体中，并被其中的两种蛋白酶丝氨酸蛋白酶位点-1(serine protease site-1，S1P)和金属蛋白酶位点-2蛋白酶(metalloprotease site-2 protease，S2P)切割成活性形式。活化的ATF6调节内质网应激分子伴侣GRP78及折叠酶蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)等的表达，并与IRE1协同参与ERAD途径[1]。研究表明，适应性的ERS可减少蛋白质的合成，促进内质网腔中蛋白质的正确折叠，增强ER的降解功能，从而减轻ER负荷，维持ER的稳态并有利于细胞存活。而严重和持续的ERS则会损伤细胞，最终导致细胞死亡[2]。

二、内质网应激与氧化应激

氧化应激是指机体在各种因素刺激下，体内ROS和活性氮自由基(RNS)产生过多，超过机体抗氧化系统对其的清除能力时，氧化系统和抗氧化系统失衡的过程。ROS产生过多可导致细胞生物大分子(蛋白质、脂质和核酸)的结构和功能的改变，能量代谢以及信号转导通路受损，进而导致细胞损伤。与一般细胞比较，胰岛β细胞内的抗氧化酶水平比较低，对氧化应激造成的细胞损伤更加敏感。越来越多的研究表明，氧化应激可以扰乱ER功能，诱导ERS来介导细胞损伤。ER中蛋白质的正确折叠需要一个“独特”的高度氧化和丰富的钙环境。ROS产生过多时，一方面可以抑制内质网氧化还原酶1α(endoplasmic reticulum oxidoreductin1α，ERO1α)和PDI，导致错配的二硫键的生成，扰乱蛋白质的正确折叠，从而诱发ERS。另一方面，ROS 还可以抑制钙泵，激活1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphate receptor，IP3R)和ryanodine受体(RYR)等Ca2+释放通道, 促进内质网腔内Ca2+的释放，进一步诱导ERS[3]。Liu等[4]研究发现，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以通过改善ERS来减轻由甲基乙二醛引发的糖毒性介导的胰岛β细胞功能障碍，从而说明氧化应激确实可以通过介导ERS来影响胰岛功能。

有研究表明，ERS也可以诱导氧化应激，加重细胞损伤。研究发现，ERO1α和PDI在介导二硫键形成过程中产生的硫醇基团电子可以转移到分子氧以生成过氧化氢，继而增加ROS的产生。而GRP78结合错误折叠蛋白质并帮助其正确折叠的过程需要消耗ATP，线粒体氧化磷酸化在供能的同时还会产生ROS作为副产物。此外，ER中Ca2+紊乱还可增加胞质和线粒体中Ca2+负荷，导致自由基生成增加，加重胰岛细胞凋亡[3]。综上所述，ROS可以在ERS的上游或者下游起作用，由此证明ERS与氧化应激之间可能会形成恶性循环，严重威胁胰岛细胞的正常功能。

三、内质网应激与细胞凋亡

β细胞生成和分泌胰岛素的功能依赖于高效的UPR。正常功能的ER有利于胰岛素原的合成，而ER稳态紊乱不仅可以导致胰岛素分泌受损，还会诱导细胞凋亡[2]。C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)通路、IRE1/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路和caspase-12通路等至少3个途径参与ERS介导的细胞凋亡。

CHOP是ERS中最主要的促凋亡蛋白质之一，也是ATF4驱动的重要靶蛋白之一，其可通过引起促凋亡蛋白如Bax、Bim、死亡受体5(DR5)等表达的增加和抗凋亡蛋白Bcl-2等表达的降低来介导细胞凋亡。Allagnat等[5]研究发现，敲低CHOP的表达可抑制Bcl-2和Mcl-1水平的减少，并阻断caspase-9和caspase-3的活化，从而保护胰岛细胞免受炎性因子诱导的凋亡。此外，CHOP介导的凋亡还与ER Ca2+紊乱密切相关。正常生理条件下，ER主要通过IP3R和RYR将ER腔内的Ca2+释放入胞质，并通过钙泵将胞质中的Ca2+摄取到ER，从而维持Ca2+动态平衡。而在ERS状态下，CHOP通过激活ERO1α，增加IP3R介导的ER中Ca2+的流出。从ER 中释放的Ca2+进一步激活钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ，触发线粒体凋亡途径[6]。

此外，在持续ERS状态下，活化的IRE1招募肿瘤坏死因子受体相关因子2 (TNF receptor-associated factor 2，TRAF2 )，与凋亡信号调节激酶1(ASK1)形成的复合体可激活JNK，从而进一步促进Bax/Bid转移到线粒体膜上，诱导膜穿孔以及Cytochrome c的释放，触发细胞凋亡。Lee等[7]研究发现，通过抑制IRE1/JNK信号通路可降低caspase-3和PRAP的活性以及Bax的表达，并诱导Bcl-2的表达，从而抑制ERS介导的胰岛素瘤细胞凋亡。

caspase-12是定位于ER膜上的半胱氨酸蛋白酶，可介导ERS特异性的细胞凋亡。研究表明，caspase-12的活化也与IRE1/TRAF2复合体的形成有关。被激活的caspase-12可进一步作用于caspase-9和caspase-3，从而引发细胞凋亡。此外，ER储存Ca2+的大量释放也可以激活钙蛋白酶原转化为钙蛋白酶(calpain)，并发挥其蛋白水解作用，切割pro-caspase-12成活性形式。研究发现，饱和游离脂肪酸通过增强calpain-2活性，来介导CHOP以及caspase-12的激活，诱导β-TC3小鼠胰岛细胞的凋亡[8]。

四、内质网应激与焦亡

长期高糖、高脂条件下，细胞因子大量生成，其造成的炎性反应可对胰岛细胞活力以及胰岛素分泌功能产生不同程度的损伤，进而导致胰岛细胞凋亡及功能障碍。而ERS与炎症之间可以通过多种机制偶联，主要涉及到JNK、NF-κB以及核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体蛋白3(NOD-like receptor3，NLRP3)炎性小体。最近研究发现焦亡(pyroptosis)，一种新的炎性细胞死亡，在胰岛损伤中发挥着重要的作用。因依赖的炎性caspases不同，焦亡可分为经典(caspase-1依赖性)和非经典(caspase-4/-5/-11依赖性)两种途径。其中经典焦亡途径诱导细胞损伤的机制主要包括caspase-1以及NLRP3炎性小体的激活。NLRP3炎性小体是由NLRP3、pro-caspase-1以及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)构成的复合体。该复合体的活化与多种“危险因素”(炎性因子、ROS、钾离子外流以及组织蛋白酶释放等)的刺激有关。研究显示NLRP3、caspase-1或ASC基因缺陷的小鼠可以抵抗高脂饮食诱导的脂肪变性与胰岛素抵抗[9]。在持续的高血糖的状态下，ROS会产生过量，并通过上调NF-κB和硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)的表达，促进NLRP3炎性小体以及caspase-1的活化。活化的caspase-1一方面可以对IL-1β和IL-18的前体进行切割，使其成熟并进一步诱导其他炎性因子的合成和释放；另一方面还可以通过切割Gasdermin D，诱导质膜穿孔、细胞肿胀破裂以及焦亡小体的形成[10]。

ERS状态下，高度活化的IRE1α也可以通过上调TXNIP的表达来激活NLRP3炎性小体，以进一步诱导炎症和焦亡。Pei等[11]研究发现，ERS抑制剂牛磺酸可以通过减少IRE1α的磷酸化和下调TNF-α的水平，来抑制NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡，进而保护β细胞免受无机砷诱导的胰岛功能障碍。Chou等[12]也研究发现，药物抑制剂STF-083010处理或XBP1被敲除后可以选择性抑制IRE1/XBP1途径，并显著减弱镉诱导的NLRP3炎性小体活化和细胞焦亡。此外，CHOP也与ERS介导的细胞焦亡密切相关。Lebeaupin等[9]用siRNA敲低CHOP的表达可以显著降低活化的caspase-1、caspase-11和IL-1β的水平。Simard等[13]通过1,10-邻菲咯啉(S2P蛋白酶抑制剂)阻断ATF-6切割，能够缓解银纳米颗粒诱导的细胞焦亡以及IL-1β等炎性因子分泌，由此表明ATF6通路在细胞焦亡的激活中也发挥着一定的作用。因此，由ERS引发的细胞焦亡可能成为胰岛损伤的调控机制之一。然而，ERS诱导细胞焦亡的具体机制尚待阐明；其次，细胞焦亡在糖尿病中的研究虽已有所涉及，但研究尚浅，仍需更深层次地探索研究。

五、内质网应激与自噬

自噬是细胞内异常蛋白质、受损细胞器、大分子物质以及毒性聚集体在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。适度的自噬通过清除受损的细胞器和聚集蛋白以及促进生物能量稳态来维持胰岛正常功能，但过度或受阻的自噬会导致受损细胞器和蛋白质的积累，诱导胰岛损伤。

另有研究表明，ER是自噬体膜的主要来源，参与自噬体起始结构的形成。在自噬缺陷的β细胞中可观察到ER扩张以及受损蛋白质的积累，提示ERS在自噬过程中起着重要的作用[2]。同时有研究证实ERS诱导激活自噬的分子机制主要包括Ca2+/5′-一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)、IRE1-TRAF2-JNK和PERK-eIF2α通路[2]。首先，采用RNA干扰和药理抑制剂得到的结果显示，ER中释放的Ca2+可促进钙调蛋白依赖激酶β(CaMKKβ)/AMPK依赖性途径抑制mTOR，继而促进UNC51样激酶(UNC51-like kinase，ULK)的磷酸化以及自噬前体的形成，最终诱导自噬。其次，非应激状态下，Bcl-2与Beclin1结合并抑制后者的活性，使其不能有效诱导自噬。而在ERS早期状态下，JNK通过磷酸化Bcl-2，导致Bcl-2/Beclin1复合体的解离和自噬的激活[2]。Kong等[14]研究发现，4-PBA(ERS抑制剂)和SP600125(JNK抑制剂)预处理可以显著抑制自噬标志物微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain3Ⅱ, LC3Ⅱ)、Beclin1的表达和P62蛋白的降解以及缓解自噬空泡的形成。此外，PERK/eIF2α的磷酸化还可以介导自噬相关蛋白12(autophagy-related protein 12，ATG12)的激活以及LC3的裂解和脂质化过程来激活自噬。Song等[15]通过GSK2606414抑制剂或siRNA PERK敲低PERK的表达可以阻断由PERK/eIF2α/ATF4通路激活的自噬，加重间歇性低氧诱导的胰岛损伤。总之，ERS介导自噬的调控机制非常复杂，涉及到多种信号通路，而这些通路可在ERS不同阶段调控自噬过程。

大量研究表明，ERS介导的自噬是胰岛细胞的防御机制。有研究证实自噬抑制剂E-64d/pepstatin A 预处理会增加ERS诱导的β细胞凋亡以及胰岛素分泌功能障碍[16]。ERS状态下，一定程度的自噬可以通过清除泛素化的错误折叠/未折叠蛋白质，抑制caspase级联反应以及清除P62来缓解ERS介导的细胞凋亡，从而发挥维持细胞稳态的作用。然而，应激程度或者时间持续增加将会诱导自噬依赖性死亡，并加重细胞损伤。有研究表明，牛磺酸可以保护大鼠胰腺免受三氧化二砷引起的自噬性损伤[17]。Guo等[18]研究发现,4-PBA也可通过抑制氧化应激与ERS诱导的自噬，缓解生长因子颗粒素蛋白前体介导的胰岛素抵抗。因而过度ERS状态下，自噬可通过诱导细胞死亡及胰岛素抵抗加重胰岛损伤。而目前研究绝大多数主要侧重于ERS状态下自噬的保护机制，但就ERS介导的自噬性细胞死亡在胰岛损伤中的作用机制研究尚浅。

六、适应性的ERS与细胞存活

目前，对于ERS在胰岛损伤机制中的研究大多局限在细胞凋亡方面。然而，近些年也有研究表明适应性的ERS有利于维持胰岛存活。在糖尿病小鼠的移植胰岛中，慢性高血糖可诱导PERK/IRE/ATF6 3条通路上相关的UPR基因(如GRP78、氧调节蛋白150、内质网蛋白72等)的下调，β细胞去分化及功能障碍，进而导致移植效果差以及进行性β细胞衰竭[19]。Engin等[20]研究发现，通过腹腔注射ERS抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，可以抑制XBP1s以及ATF6水平的下调，恢复UPR以减少胰岛细胞凋亡，改善胰岛素分泌功能以及胰腺进行性淋巴细胞浸润。在糖尿病易感的肥胖小鼠中，UPR的失代偿还可联合氧化应激、炎症导致β细胞表型的丧失和细胞死亡，最终导致2型糖尿病的发生、发展[19]。由此可见，轻度或者适应性的ERS可以通过UPR缓解胰岛损伤。另有研究表明，适应性的ERS也可通过相关途径激活抗氧化转录因子，进而增加抗氧化酶的表达来缓解氧化应激，维持细胞内氧化还原稳态。Yang等[21]研究发现PERK/红系衍生的核转录相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)信号通路参与ERS与氧化应激的调节。磷酸化的PERK介导Nrf2/KalCh样的ECH相关蛋白1(Keap1)复合物的解离，游离的Nrf2随后转入核内，激活一组Ⅱ期解毒酶，以改善高血糖状态下ERS和氧化应激诱导的细胞凋亡。故而，适应性的ERS也可通过调节氧化应激改善糖尿病并发症。

而在ERS的3条信号通路中，IRE1信号通路介导的UPR的保护作用研究较为深入。Chan等[22]研究发现，基因敲低XBP1的表达可诱导CHOP以及JNK的活化，加重炎性因子介导的胰岛细胞凋亡，而IRE1/XBP1介导的适应性ERS又可以保护胰岛免受炎症、氧化应激、凋亡造成的损伤。同时，Odisho等[23]也研究发现，基因敲除ATF6β也会增加β细胞对ERS介导的细胞凋亡的敏感度。如果ERS持续存在，ATF6β会被激活并诱导包括Wolfram 综合征 1(Wolfram syndrome 1，WFS1)蛋白在内的UPR相关基因的表达。WFS1蛋白将ATF6α募集到内质网E3泛素化连接酶Hrd1并促使其降解，以防ATF6α的过度激活导致的细胞凋亡。除此以外，ERS促凋亡蛋白CHOP及JNK的激活可通过抑制适应性的ERS，增强持续性的ERS，减少ER到高尔基体的蛋白质转运，继而加重缺氧诱导的胰岛损伤。由此可见，适应性的ERS与持续性的ERS之间可能存在着转换机制，且不同类型的细胞对ERS的适应性程度也多有差别。因此，关于外界刺激的“度”以及ERS相关转换机制还需要进一步的研究。

七、展 望

适应性的ERS引起的UPR可以通过恢复ER稳态，激活保护性自噬，而有利于维持胰岛细胞存活；另一方面，过度的、持续的ERS将启动不同形式的细胞死亡如细胞凋亡、焦亡及自噬。近年来，ERS与糖尿病发病机制的相关性研究取得了很大的进展。有研究表明常见降糖药可以通过调节ERS发挥胰岛保护作用，然而临床上降糖药调控ERS的具体机制还未可知，而且就ERS参与糖尿病发生、发展的分子机制仍存在许多需要迫切解决的问题。解决这些问题可能更好地解释不同程度的ERS在胰岛损伤中的作用机制，更有利于为糖尿病的治疗提供新的有效策略。