反刍动物甲烷排放的测量及其调控研究进展

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(1.铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300；2.贵州省畜禽健康养殖协同创新中心，贵州 铜仁 554300；3.贵州省饲料饲草安全与高效应用工程研究中心，贵州 铜仁 554300)

近100多年以来，由于温室气体的排放，导致全球气候变暖。全球气候变暖不仅是人类面临的最严峻的环境问题，也是制约社会经济发展乃至人类生存的重要问题。甲烷(Methane，CH4)是主要的温室气体之一，CH4在空气中含量低于二氧化碳(Carbon dioxide，CO2)，但单位体积的CH4造成的温室效应是CO2的30倍。全球有50%～60%的CH4排放来自于农业生产，而每年进入大气层中由家畜产生的CH4约7.7×107t，绝大部分CH4气体来源于反刍动物。反刍动物在瘤胃发酵过程中会产生大量CH4，有2%～15%的饲料能以CH4的形式被损失掉[1]。所以，反刍动物产生CH4，既造成了能量损失，也是导致温室效应的主要原因之一[2]。因此，抑制瘤胃CH4的产生对提高饲料能量利用率和减轻温室效应都具有重要的作用。反刍动物CH4排放的测量方法有很多，不同方法的应用、成本、准确度、精密度和可重复性都各不相同。目前开发新CH4测量技术，提高现有方法的精度，比较各种CH4测量方法已成为一个重要的研究领域。因为一种准确、经济和可重复性高的CH4排放测量技术对于评估反刍动物CH4排放量和CH4减排技术是必不可少的。本文将就CH4排放的测量方法和降低CH4排放的调控措施进行综述。

1 CH4排放的测量方法

1.1 长期测量方法

1.1.1 呼吸室技术 呼吸室(Respiratory chamber，RC)技术一直被用于动物体内能量平衡和气体交换的测定。该技术的原理是测量气体样品中CH4浓度和从呼吸室中排出的空气总量，该技术所测量的CH4是动物通过所有途径包括口腔、鼻孔和直肠所排出的[3]。空气泵能连续不断的将呼吸室中的空气排出，其开路系统中的流量计能够计算所排出的空气量，从气体出口处通过管道系统连续取样进行分析。呼吸室系统还配备了通风机以适当混合呼出的气体和进入的空气。从室外进入呼吸室的新鲜空气可通过空调系统控制其温度和湿度。温度计、湿度计和气压计则用于确定标准温度和压力条件下的气体体积。RC技术因其较高的测量精度和重复率而被认为是CH4测定的金标准，但由于其成本高、通量低、限制动物自然行为以及对操作的高技术要求大大限制了该技术的广泛应用。

1.1.2 六氟化硫示踪技术 近年来六氟化硫(Sulfur hexafluoride，SF6)示踪技术被广泛用于反刍动物CH4排放的测量[3]。该方法原理是通过瘤胃中SF6气体的生成速度测量CH4的生成量。将充满SF6的小渗透管放入反刍动物的瘤胃中，试验动物配备的气体取样装置由一个支撑毛细管的龙头和一个真空罐组成，毛细管的入口靠近鼻子，真空罐用于收集气体样品，气体样品包含有呼吸气体和嗝出气体。CH4排放量是根据SF6释放率、真空罐中气体样本中 SF6和CH4浓度以及背景空气中 SF6和CH4浓度计算所得。SF6示踪技术在不影响放牧动物自然行为的前提下，具有较大的生产量，但与RC技术相比，其CH4测量值变化较大[4]。尽管如此，SF6示踪技术仍是近期大力推荐使用的CH4测量方法。

1.1.3 通风罩或头箱技术 通风罩技术测量CH4原理与RC技术相同[5]。在该技术中，制作一个头箱或通风罩以容纳动物的头部，头箱足够大可以允许动物不受限制地移动头部并自由采食和饮水，通过从通风罩中抽取空气样本以分析进入和排出气体中的CH4浓度。与RC技术相比，该方法不能测量直肠所排出CH4浓度。排出气体的流速对分析头箱中气体的准确性和动物的舒适度有重要的影响。该系统还可以用于饲料的营养评价和能量代谢。与SF6技术相比，该技术动物间CH4测量值差异较大。与RC技术相比，该技术成本较低，但是动物需要经过训练才能适应头罩，这限制了该技术的广泛使用，该方法不适用于大批量动物的CH4测量。

1.2 短期测量方法

1.2.1 面罩法 面罩法一直被用于牛、绵羊和山羊呼吸交换和CH4测量时的现场取样。该技术需要训练动物在测量的时候保持俯卧姿势，24 h内重复多次测量，每次测量时间约为30 min。该方法测量时动物日变化和动物间变化较大，只能提供一个短期的排放率。使用该技术测量CH4排放量时很大程度上取决于呼吸交换的次数和时间，还与动物每天的饲养周期相关。但是如果在24 h测量期间，同时从几只动物收集足够的数据则可计算出典型的CH4排放模式[6]。面罩法可用于短期测量CH4排放率，用于大量动物的筛选，但可能导致动物明显的不适、痛苦和行为改变，从而影响气体的测量。

1.2.2 便携式蓄积室 便携式蓄积室(Portable accumulation chamber，PAC)系统本质上是一个没有气流的呼吸室[7]。PAC系统能够收集所有呼出的气体，而O2在收集周期1～2 h内就会耗尽，在收集周期结束时进行一次CH4和其他气体的测量。CH4排放量由经校正的CH4浓度乘以蓄积室的容积。该技术的使用时间应加以限制，以避免增加蓄积室内CO2浓度所引起的不利影响，因此PAC系统本质上是一种短期呼吸测量方法。在不同地区的研究中，使用PAC系统测量单个绵羊CH4排放量的可重复性不高[8]。该技术可用于大群动物中筛选低CH4产量动物以达到遗传改良的目的。

1.2.3 CH4/CO2比值技术 CH4∶CO2比值法是根据CO2排放量和使用气体分析仪测量CH4和CO2浓度计算动物CH4排放量。该方法是利用基于傅里叶变换红外线(Fourier transform infrared，FTIR)检测的气体分析仪分析空气样本中的CH4和CO2浓度，并将动物呼出的CO2作为示踪气体。CO2排放量可根据能量代谢、产热和呼吸商或碳平衡进行预测。消化和代谢活动的差异，采食量和饲喂频率等因素均可能影响该技术CH4测量值[8]。因此，应该在一天的不同时间进行足够的测量以解释动物体内CH4和CO2排放的日变化和餐后变化。该技术可以用于大规模动物CH4测量。

1.2.4 青饲料系统 青饲料(GreenFeed，GF)系统主要被用于测量动物产生的CH4、CO2和H2。该系统包括一个自动下料系统、空气流量和气体浓度测量系统、电子和通信设备、气体示踪设备和识别动物进入的动物检测系统。在GF系统中，CH4排放是在短时间内测量的，当动物进入该系统采食时既可以测量动物CH4排放量。该系统可以将单个动物在每天不同时间CH4排放量综合在一起以评估动物平均每日CH4排放量。试验人员可以控制饲料供应的时间，以合理分配一天中CH4测量时间。该技术通过自动进料系统不断抽出空气以测量流量，从而测量进食期间的CH4排放量[9]。该技术需要经过一段时间以收集足够数量测量值才能准确评估动物日排放量。由于动物间和一天中差异较大，所以在对不同处理之间CH4产量进行测量时，GF技术需要更多的时间和动物[10]。GF技术测量CH4排放量时表现出较高的差异性，但由于GF技术成本较低，所以在室内和放牧条件下测量CH4排放量时GF技术可作为SF6和RC技术的替代方法。

1.2.5 嗅探器方法 在嗅探器技术中，取样口被放置在自动挤奶系统的饲料槽中，以收集挤奶期间牛所嗝出的气体。使用数据记录器以1s的间隔不断的对饲料槽中的空气进行采样、分析和记录，以测量靠近动物口鼻处的CH4和CO2浓度。该技术利用动物打嗝频率和每次嗝出CH4量来评估动物挤奶期间CH4排放率。使用RC技术测量CH4排放量和用该技术测量CH4排放率之间存在正相关关系。与嗅探法相比，GF技术测量奶牛CH4排放量间的变异系数更小，两种技术的测量值之间相关性极低，这可能是由于饲料槽的结构、动物口鼻移动和位置不一样导致饲料槽内空气混合不一致引起的[9]。

1.2.6 手持激光CH4探测器方法 手持激光CH4探测器(Hand laser CH4detector，LMD)技术可以测量正常环境下动物鼻子或嘴附近呼出气体中CH4浓度[14]。数据由代表动物呼吸周期的一系列峰值组成，分析时只用由于呼气和嗳气所引起的CH4浓度增加的峰值[11]。与嗅探器技术不同的是，该方法测量时是在靠近动物鼻孔气体中进行的，因此测量不受头部位置的影响。LMD技术还能较好地检测CH4浓度高时段，避免对CH4浓度低时段的错误分析。该技术允许在正常环境下重复测量同一动物CH4排放量，而嗅探器技术和GF技术在挤奶和喂食期间的测量则是受限制的。但是，LMD技术操作劳动强度大，风速、风向、温度、湿度和大气压等气象因素都能影响测量的准确性和精度，风速是影响放牧和室外测量的主要因素。LMD技术还需要进一步改进才适用于正常管理条件下大量动物的CH4检测以用于农场动物的筛选。

1.2.7 甲烷罩系统 Troy等[12]设计了一种新的方法用于测量动物饲喂过程中CH4的排放。该方法可用于测量群体饲养环境中单个动物的CH4产量。甲烷罩的设计主要是用于部分封闭饲料箱上方的气体，从而测量气罩中CH4的浓度。在甲烷罩技术中动物进入测量系统的次数比GF技术高，这能提高甲烷罩技术的的准确性。以硝酸盐作为CH4抑制剂处理以测量CH4排放量，发现该技术与RC技术测量结果具有可比性，均能检测出硝酸盐处理后CH4排放的显著差异。对于测量自然环境中群养的单个动物CH4排放量，该技术可以算一个更好的选择。

1.3 间接测量方法

1.3.1 体外发酵法 体外瘤胃发酵技术被广泛用于饲料营养价值的评价。在可控的试验条件下，通过瘤胃微生物对饲料进行长期发酵(瘤胃模拟技术)和短期发酵(产气方法)。通过测定体外发酵过程中总产气量，分析气体中CH4浓度，得到体外发酵的CH4产量。利用该方法可以确定总产气量和CH4产量的最大值以及产气量的动力学[13]。该技术可以通过液体位移系统，压力计装置，自动和手动的压力传感器等装置测量气体体积。介质中的碳酸盐浓度和顶部空间气体成分、封闭式与排气式瘤胃分批培养系统、底物分散在培养基中和保存在滤袋中等因素都会影响该技术中CH4的产生。尽管有很多因素影响体外发酵技术中气体和CH4的产量，但由于该技术成本低而且操作简单可以用于快速筛选CH4减排的饲料和添加剂。

1.3.2 CH4预测模型 预测模型可以预测反刍动物CH4排放而不需要进行大量昂贵的测量试验。因此，预测模型被广泛用于估计国家或全球动物的CH4排放量。预测模型可分为统计模型和动态机械模型，统计模型是直接通过营养摄入估算CH4排放量，动态机械模型是使用瘤胃发酵生物学的数学描述来预测CH4排放量[14]。与统计模型相比，机械模型更具有优势，可用于评价农场或国家水平使用的CH4减排技术的有效性。统计模型只能根据动物数量和饲料摄入量的变化来评估CH4排放量的变化。统计模型的优点在于他们依赖的变量较少(例如DM摄入量、饲粮水平、膳食脂肪比例、膳食纤维比例等)，可以在一个简单的电子表格中执行，而且简单易懂可以在各种数据集上进行测试，缺点是该模型不依赖于瘤胃CH4生成的生物动力学。目前许多国家都使用统计模型来估计反刍动物的CH4排放量。

1.3.3 替代物测量法 目前已有研究用于开发通过测量牛奶和粪便中某些成分含量来预测CH4排放量。比如通过检测牛奶中某些脂肪酸的浓度，以此作为预测奶牛CH4排放量。该方法的假设是牛奶或粪便中特定脂肪酸与饲料成分或瘤胃产甲烷菌的数量有关，这些都会影响瘤胃CH4的排放，牛奶脂肪酸谱与CH4排放之间存在一定的相关性[15]。与脂肪酸组成相比，用FTIR分析仪测定牛奶的中红外光谱(受牛奶中脂肪酸组成的影响)能够更直接更好地预测CH4排放量。太古醇是一种广泛存在于产甲烷菌中的膜脂，可以作为牛CH4排放测量的替代物。该方法可以用于预测动物CH4排放量以筛选低CH4排放动物。

2 降低瘤胃甲烷排放的措施

2.1 调节油脂种类和使用量

在反刍动物的日粮中添加脂肪或脂肪酸可以减少CH4的排放[14-16]。在日粮中补充的膳食脂肪每增加一个百分比将减少4.3%CH4排放[16]。当日粮中脂肪的浓度高达6%时，不但会增加牛奶的产量，而且还能降低约15%CH4的排放量[16]，但当脂肪浓度超过这个浓度的时候可能会降低生产效率，因为高浓度的脂肪会影响瘤胃的发酵。在脂肪酸中，C12:0，C18:3和多元不饱和脂肪酸具有明显的CH4抑制作用，但是饱和长链脂肪酸对CH4的抑制效果较差[15-16]。含有高浓度脂肪的副产品(比如酿酒糟、玉米粥、葡萄渣)能有效减低CH4的排放[15]。给奶牛补充饲喂棉花籽会大幅度减少CH4的排放而不会影响产奶量[17]。酿酒糟、冷榨油菜籽、玉米粥这三种副产品都可以大幅度减少奶牛肠道CH4排放[18]。给奶牛饲喂红葡萄籽可以减少约20%的CH4排放。红葡萄籽中除了含有脂肪外，还含有许多次生化合物比如单宁酸，对苯二甲酸和白藜芦醇，这些成分也有可能会抑制CH4的生成。

2.2 添加不同植物次生化合物

有些植物次生代谢物存在于饲草和植物提取物中，这些次生代谢物均有潜在的瘤胃CH4抑制作用[19]。许多富含单宁酸和皂苷的饲料作物能够降低瘤胃CH4的产生[20]。单宁酸可以直接通过抑制甲烷菌生长而减少CH4的生成，另外还可以通过减少纤维的消化和原虫的数量来降低氢的产量从而间接地减少CH4产量。

针对不同饲料作物的研究显示，大多数种类的饲料作物饲喂绵羊后CH4的产量相似，但是，相比黑麦草和其他芸苔属植物(芜菁和羽衣甘蓝)，蕉青甘蓝和饲用油菜能够显著降低CH4的产量(约20%)，但是抑制CH4产生的机制尚不清楚。这些饲料作物中均含有硫植物代谢产物，这可能是抑制CH4产生的主要成分。但是长期饲喂这些饲草对瘤胃CH4排放的影响有待进一步研究。

在体外发酵试验中，黄酮、杨梅酮、柚皮苷、芸香苷、槲皮黄酮和山柰酚均能显著减少CH4生成，其抑制效果依次为：杨梅酮≥山柰酚≥黄酮≥槲皮黄酮≥柚皮苷≥芸香苷≥儿茶素，儿茶素在体内试验和体外试验中均能抑制瘤胃CH4的生成[21-22]。儿茶素能够直接抑制甲烷菌生长，也可以通过瘤胃微生物降解过程和还原性脱羟基反应降低氢含量从而减少CH4产量[21]。

2.3 添加适量硝酸盐

硝酸盐作为电子吸收剂直接抑制产甲烷菌生长从而减少CH4产生[23-24]。硝酸盐主要是通过其还原中间体亚硝酸盐的毒性和其对氢的竞争来改变瘤胃微生物菌群结构，从而减少CH4的产生[25]。在饲料中添加硝酸盐不但能够减少CH4的排放，而且硝酸盐还能为瘤胃微生物生长提供氨，从而降低了对日粮中蛋白的需求。硝酸盐作为一种膳食补充剂，当和低氮日粮一起饲喂奶牛时可以减少CH4排放量。但是通过添加食用硝酸盐补充剂可能会增加亚硝酸盐中毒的风险，尤其是在含有高浓度的硝酸盐和粗蛋白的草料中添加时中毒的风险更大。

2.4 添加卤代化合物

卤代化合物作为瘤胃CH4抑制剂的研究甚多[26]。一些海洋植物比如红藻、藻类和真菌都含有大量的溴仿和其他卤代化合物，这些海洋植物最近被开发用于抑制瘤胃CH4的生成[26]。在体外试验中，红藻能减少99%的CH4排放。因此，将红藻添加到反刍动物的日粮中可能是一种较好的减少CH4产生的方法。但是，体内试验中的最佳剂量水平和毒性作用有待研究。

2.5 调节硝基氧化合物使用量

新型抑制剂3-硝基氧丙醇(nitrooxypropanol，NOP)和乙基-3NOP具有特定的抗CH4特性。甲基辅酶M还原酶是生成CH4的最后一步所必须的酶，NOP干扰了产甲烷菌的甲基辅酶M还原酶的合成，从而降低了CH4的产量和抑制了甲烷菌的生长[27]。当NOP以每头牛0.5/2.5 g(25/125 mg/kg DM)的剂量通过瘤胃管直接到达瘤胃时，CH4的产量能降低7%～10%，但是高剂量的NOP会导致消化率降低[28]。当以2.5 g/d剂量的NOP与日粮混合后饲喂牛时会减少60%的CH4排放，这种饲喂方式的优点就是能够确保NOP在一天中能够持续摄入。用40～80 mg/kg NOP的剂量饲喂奶牛会减少30%的CH4产量[29]。以2.0 g/d的量在牛的日粮中添加3NOP会减少59%的CH4排放，试验持续112 d，期间对牛的进食量，营养消化率和总挥发性脂肪酸的浓度都没有影响，3NOP能够减少产甲烷菌的数量，但是却增加了原虫的数量[30]。同样，需要不断向牛的日粮中添加3NOP以确保牛能够持续摄入3NOP才能使CH4的排放达到最佳抑制效果。以2.5 g/d的量在奶牛的饲料中添加3NOP会减少37%的CH4排放。在绵羊的日粮中以0.5 g/d的量添加3NOP会减少29%的CH4排放，同时对消化和瘤胃发酵不会产生不利影响[28]。

2.6 添加不同真菌代谢物

洛伐他汀是真菌繁殖期的一种次生代谢物，它能抑制胆固醇生物合成的关键酶(如：3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶)[31]。含有洛伐他汀的土曲霉菌在发酵稻秸时能显著降低CH4产量和产甲烷菌的数量，但同时也降低了少数纤维降解菌的数量[31]。醚链长链异戊二烯醇是古生菌细胞膜脂质的核心成分，是由一种关键前体甲戊酸钠生成的。甲戊酸钠是由HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA合成的，这是人类胆固醇合成中的一个中间速度限制反应。洛伐他汀是HMG-CoA还原酶的抑制剂，可抑制异戊二烯醇的合成，从而延缓古生菌细胞膜的形成和产甲烷菌的生长[31]。沃尔夫被孢霉腐生真菌菌株也是一种潜在的CH4抑制剂，同时不降低整体发酵水平。给绵羊饲喂红曲霉发酵的大米后，红曲霉产生的真菌代谢产物(可能是普伐他汀和美伐他汀)能减少30%的CH4排放，这可能与瘤胃中较低的乙酸丙酸比值和产甲烷菌数量减少有关[32]。

2.7 添加不同微藻类

目前微藻类已被证实能够抑制瘤胃CH4的生成。钥形毛藻以总底物有机物2%的量添加时,不仅能使CH4的产量降低99%，还能降低挥发性脂肪酸的产量[33]。当鞘藻的添加剂量大于有机物的50%时，降低CH4产生的效果较差。当同时添加钥形毛藻(2%OM)和鞘藻(25%和50%OM)时也能抑制CH4的产生，但与鞘藻的添加剂量无关。在体外实验中，褐藻已被确定为有效的CH4抑制剂。有一种含有20%二十二碳六烯酸的海藻粉，以每天375 g/头的量饲喂奶牛，相当于每天饲喂每头奶牛75 g二十二碳六烯酸，但对奶牛体内的CH4产生没有影响，这可能是由于这种脂肪酸的浓度较低而不能抑制CH4的产生[34]。

2.8 甲烷抑制剂的联合使用

通常情况下，大部分CH4抑制剂都是单独使用以评估其在反刍动物体内降低CH4排放的能力。当以高浓度剂量添加CH4抑制剂时，通常会对饲料的消化和瘤胃发酵产生不利影响，从而以达到抑制CH4排放的效果[35]。其中一些抑制剂在大剂量使用时也会对动物产生毒性[14]。当CH4抑制剂添加量较低时，可以克服其对瘤胃发酵的不利影响和对动物的毒性作用，但在低剂量下对CH4排放的抑制没有显著作用。将具有互补作用的CH4抑制剂组合使用时可协同降低CH4的排放，而不会对饲料的消化和瘤胃的发酵产生不利影响[36]。在一项体外瘤胃发酵试验中，硝酸盐和皂树皂苷的组合能够有效的抑制CH4的排放，5 mM硝酸盐和0.6 g/L皂苷组合时CH4抑制量为32%， 10 mM硝酸盐和1.2 g/L皂苷组合时CH4抑制量为58%[35]。硝酸盐和皂树皂苷的二元组合可多管齐下地减少CH4的排放：1)皂苷能够抑制瘤胃内原生动物的数量，降低了原生动物的产氢量，减少了原生动物相关的甲烷菌丰度；2)硝酸盐主要是作为一种强电子接收器，与二氧化碳竞争电子；3)硝酸盐还原的第一中间体亚硝酸盐对产甲烷菌有直接毒性。高剂量的亚硝酸盐和皂苷组合添加会降低瘤胃纤维降解率[23]。大蒜油对瘤胃甲烷菌有直接抑制作用，其作用机制主要是通过抑制瘤胃产甲烷菌的脂质合成。皂苷+硝酸盐+硫酸盐、大蒜油+硝酸盐、大蒜油+硝酸盐+皂苷这三种组合对抑制CH4的产生均有叠加效果[24]。含β‐和α‐酸的啤酒花和丝兰皂苷作为添加剂联合使用时能够有效降低CH4的排放[37]。在不改变饲料消化率的情况下，硝酸盐(3%硝酸钙)能够降低奶牛体内22%CH4的生成，亚麻籽油(占日粮的4%)能够降低奶牛体内17%CH4的生成，当两者联合使用时可降低奶牛体内32%CH4的生成[38]。CH4抑制剂的联合使用可以在不影响饲料消化率的情况下大幅度降低CH4的产生，但需要更多体内研究以确定实际应用中最佳组合剂量。

3 展 望

CH4测量方法可根据不同的试验目的被用于不同的研究中，比如饲料和饲料添加剂的营养评价以及动物遗传的筛选。为了克服现有CH4测量方法的局限性，一系列新的方法正在被开发。没有一种方法是适用于所有条件下CH4的测量，每一种CH4测量方法都有其优点和局限性，一种CH4测量方法能适用于一种特定条件下CH4测量就很有应用价值了。现已经研究出一些新的CH4减排技术，但是只有少数技术是实用且具有成本效益可以应用到农场中以降低CH4的排放。在实际应用中可以结合多种CH4减排技术同时使用以大幅度减少反刍动物CH4的排放，既能提高饲料的利用率又能减少环境污染的CH4减排技术在实际应用中被采用的可能性更大。比如，在日粮中补充脂肪可以减少CH4的产生，并提高动物的生产力。同样，当在日粮中添加硝酸盐时可以在日粮中减少昂贵的蛋白质膳食的添加。然而CH4抑制剂的使用是否会在牛奶和肉类产生相关的毒性和残留物必须通过在动物体长期试验来进行评估。许多真菌在某些生长条件下可能会产生有毒的代谢物，在实际饲喂动物过程中必须避免[39]。未来在CH4减排上的研究重点包括两方面，一方面是短期战略，包括日粮改变和动物管理；另一方面是长期战略，包括植物种植、动物育种以及瘤胃微生物调节，从而有利地减少碳排放，促进未来畜牧生产系统和生态环境的可持续发展。