铁皮石斛基因克隆的研究进展

杨鹤同， 史 俊， 席刚俊

(江苏农林职业技术学院， 江苏 句容 212400)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)(干品称铁皮枫斗)属国家二级保护植物。在我国自然分布于浙江、安徽、福建、湖南、广西、四川和云南等地人迹罕至的悬崖峭壁背阴处的石缝里，生长期3～5 a，是名贵的药食同源滋补佳品，除此以外，铁皮石斛还有“药中黄金”、“药界大熊猫”、“中华九大仙草之首”等美誉。其显著的药用价值和市场价值导至其在20世纪80-90年代遭到掠夺性采挖，加上铁皮石斛种子微小，需与真菌共生才能萌发，其萌发率极低，造成铁皮石斛野生资源濒临灭绝。

多年来，为改变其濒危状态，科研人员对铁皮石斛进行了大量研究，但研究多集中于种质资源调查，种苗快繁、栽培等应用研究方面。近年随着研究的不断深入，种苗快繁、规模化栽培等技术相继被攻克。为了更好地提高铁皮石斛产量及品质，增加有效成分含量，提高抗逆水平等，对铁皮石斛重要基因的研究提上了日程。到目前为止，人们已通过图位克隆、RACE、RT-PCR、mRNA差别显示等技术成功分离克隆了多个基因，通过对其功能进行初步分析发现，这些基因大多与铁皮石斛有效成分合成、生长发育及抗逆等方面相关。笔者等通过对铁皮石斛基因克隆相关研究进行综述，以期为铁皮石斛功能基因组的研究提供参考。

1 与有效成分合成相关的基因克隆

1.1 多糖

铁皮石斛的主要有效成分为石斛多糖，是水溶性多糖，合成石斛多糖所需的单糖主要有葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖等，其中，葡萄糖含量达64.7%，而这些单糖主要来源于蔗糖的水解产生和衍生。孟衡玲等[1-2]于2011年和2013年采用RT-PCR和RACE法分别克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因(DOSS1)[1]和蔗糖磷酸合成酶(SPS)[2]基因，铁皮石斛蔗糖合成酶基因的cDNA全长2 424 bp，编码807个氨基酸，与兰科植物同源性高达95%，具有分解和合成蔗糖的双重属性，在调控蔗糖代谢中可能起着重要作用，但普遍认为蔗糖合成酶的主要功能是分解蔗糖，为多糖的合成提供前体。何春梅等[3]以铁皮石斛茎段为材料，分离克隆了多糖合成代谢途径中的磷酸甘露糖酶(phosphomannomutase;DoPMM)基因、GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-Mannose pyrophosphorylase;GMPase)基因以及β型甘露糖糖基转移酶(4-beta-Mannosyl-transferase)基因。GDP-Mannose 焦磷酸酸化酶(GMPase)以 D-Mannose-1-phosphate 为底物，催化生产甘露糖的活化形式 GDP-Mannose，为多糖的合成底物。β 型甘露糖糖基转移酶(4-beta-mannosyltransferase)，以 GDP-Mannose 为底物，将甘露糖转移到糖链上，主要参与β型的甘露聚糖的合成。张春柳等[4]从铁皮石斛原球茎中克隆了 2 个糖基转移酶基因(DoGAUT1 和DoPGSIP6)，其表达产物能识别不同类型受体，最终生成多糖、复合糖、糖苷化合物等次生代谢产物。张琳等[5]从云南野生铁皮石斛中分离克隆了铁皮石斛丙酮酸激酶基因DoPK，其表达产物是糖酵解途径最后一步关键限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)将高能磷酸键转移给 ADP 生成ATP 和一分子丙酮酸，对石斛多糖合成代谢有一定的调控作用。

1.2 生物碱

生物碱是铁皮石斛重要的有效成分之一，具有止痛解热、抗肿瘤的功效，对心血管、胃肠道等疾病有抑制作用[6]。铁皮石斛的生物碱大多属于倍半萜类生物碱或萜类吲哚生物碱，两类生物碱生物合成均起源于萜类途径(MEP 途径、MVA途径)[7]。吴秋菊等[8-9]从铁皮石斛中分离克隆了4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸还原酶(HDR)基因，该基因的表达产物是萜类合成 MEP 途径中的末端活性酶，为萜类合成提供前体并进行限速，表明该基因与铁皮石斛生物碱的合成与积累有关。张琳等[10-11]从铁皮石斛和霍山石斛中分离克隆了3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶(HMGR)基因，该基因的表达产物是萜类合成 MVA 途径中的第一个限速酶。张岗等[12]克隆了铁皮石斛萜类合成 MVA 途径中另一个关键酶基因鲨烯合酶基因(DoSS)，为铁皮石斛萜类物质合成代谢途径的分子调控作用研究奠定基础。林榕燕[11]从霍山石斛中克隆了2条FPS基因全长cDNA，基因表达的试验结果表明，该基因参与倍半萜类生物碱合成相关，且其表达水平与生物碱的含量呈正相关。苯丙烷类途径是植物次生代谢产物包括生物碱前体产生的主要途径，苯丙氨酸解氨酶是这一途径的关键酶和限速酶。姚瑶[13]首次从铁皮石斛中分离克隆了铁皮石斛苯丙氨酸解氨酶基因(DcPLA)，对解决石斛生物碱含量较低的问题具有重要意义。

2 与生长发育相关的基因克隆

2.1 光合作用

铁皮石斛为景天酸(CAM)代谢途径植物，随着环境条件的变化，其光合作用在CAM 与C3 途径间变化[14]。铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc)全长2 895 bp，编码964个氨基酸，表达产物催化C4 和CAM 代谢途径中的第一步反应，是光合作用源头的关键酶，在F型铁皮石斛中的表达量要远高于H型[15]。Rubisco是所有光合生物进行光合碳同化的关键酶，但只有处于活化态时，才能催化CO2固定。Rubisco活化酶(Rubisco activase，RCA)是一种核编码的可溶性叶绿体蛋白，具有调节和控制Rubisco活性的作用。崔波等[16]首次从铁皮石斛中分离克隆了Rubisco活化酶基因(DoRAC)，发现DoRAC有明显的光诱导表达特性。AP2/EREBP转录因子是具有1～2个编码高度保守的AP2/EREBPDNA结构域，该结构域包含有约60个氨基酸残基[17]。王瑜等[18]从铁皮石斛的文库中筛选得到3条AP2/EREBP家族转录因子cDNA，分别命名为TEREB5、JEREB1和AP1，对TEREB5进行深入研究发现，TEREB5可能对叶绿素合成有一定的抑制作用。

2.2 真菌共生

兰科植物是一种独特的菌根植物，菌根真菌可以侵染铁皮石斛等多种兰科植物根皮层，形成典型的兰科菌根，为铁皮石斛等兰科植物提供全部或部分的营养[19]。铁皮石斛中多个生理代谢途径参与真菌共生机制。赵明明等[20]从铁皮石斛中克隆了S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因 (DoSAMDC)，其表达产物为多胺合成的关键酶，该酶通过调节多胺的代谢途径参与植物的多项生理生化过程，具有受真菌侵染诱导表达的特性，表明其可能通过参与多胺调控途径在铁皮石斛-真菌共生方面发挥作用。张岗等[21-22]克隆了铁皮石斛钙依赖蛋白激酶基因DoCPK2、DoCPK3、DoCDPK1、DoCDPK32-like，这些基因在铁皮石斛与真菌共生中起重要作用，DoCDPK1 基因与DoCDPK32-like基因在接菌共生萌发的种子中均上调表达，广泛参与了铁皮石斛种子共生萌发的基因调控途径。促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK1 在小菇真菌侵染铁皮石斛30 d的根中，表达量显著上调，表明DoMPK1 可能在小菇真菌-铁皮石斛菌根共生早期互作过程中起作用[23]。

3 与抗逆相关的基因克隆

植物在长期的进化过程中形成了一系列用于调节自身生长发育、抵御生物和非生物胁迫逆境的机制。有多个基因和基因家族参与抗逆反应。植物存在一个信号传导系统，在其接受到胁迫信号后，并作出应答反应，最终诱导相关基因的表达来抵御各种胁迫。该系统通过一系列的信号传递最终激活或抑制某些相关基因的表达，以达到抵抗逆境的目的[24]。在调节抗逆基因表达的过程中，转录因子起着重要作用[25]。WRKY转录因子家族与植物的生长发育和胁迫应答休戚相关，是植物中非常重要的转录因子，该转录因子因其 N-末端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名[26-27]，广泛参与植物的抗逆反应，是转录调控和抗病防御反应的关键调控子[28-29]。目前已从拟南芥中分离74 个WRKY基因，水稻中也分离出 109 个成员。铁皮石斛WRKY基因克隆研究工作开展较晚，到目前为止，已从铁皮石斛中克隆了5个WRKY基因家族成员，分别是DoWRKY1[30]、DoWRKY2[31]、DoWRKY5[32]、DoWRKY11[33]和DoWRKY29[34]。

4 其他

为进一步了解铁皮石斛生理生化代谢，相关研究人员还从铁皮石斛中克隆了多个其他基因，如在铁皮石斛种子萌发中起重要调控作用的赤霉素3-氧化酶基因DoGA3ox[35]；广泛参与铁皮石斛胚胎发生过程及其他生长发育过程体细胞胚胎发生类受体激酶基因DoSEPK[36]及NAC基因家族[37]；与细胞分裂相关的铁皮石斛促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK2[38]和DoMPK4[39]；与铁皮石斛木质素合成相关的铁皮石斛咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因DoOMT[40]；控制锌离子在铁皮石斛内的生理平衡，维持铁皮石斛正常生理代谢的铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因DoZIP1[41]等。

5 小结

长期以来，铁皮石斛的研究多集中于种苗组培繁育、栽培技术和植保生防等应用领域，分子生物学等基础研究较少，还没有建立铁皮石斛的纯合系，因此在铁皮石斛基因克隆上也多采用RACE、差减抑制杂交等同源克隆法。到目前为止，铁皮石斛研究人员虽然从铁皮石斛中克隆了约50个基因，涉及铁皮石斛多糖合成、生物碱合成、抗逆和光合作用等多个方面，但由于铁皮石斛未建立起高效转基因系统，基因如何表达，具体功能是什么，基因间相互作用的机制尚不明确，这将是以后的研究方向。