热应激对家禽HPG轴结构和繁殖功能的影响及HSPs的作用

田佳迎,余哲琪,谢秀祯,陈 忠

(海南师范大学 热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南 海口571158)

随着全球气候变化的不断加剧，热应激成为家禽养殖过程中经常遇到的不利环境因素之一，而家禽是恒温动物，具有全身被羽、无汗腺、难散热等特点，在高温尤其是养殖密度过高的饲养环境中，机体易产生热应激而导致采食量下降、产蛋率及死亡率升高，给家禽养殖业带来巨大的经济损失[1]。环境高温影响家禽的生产性能，导致家禽下丘脑、垂体和睾丸等组织器官的形态学变化[2-3]，下丘脑-垂体-性腺轴是由下丘脑、垂体、卵巢或睾丸三部分构成的一条与生殖密切相关的神经-内分泌轴，它主要通过分泌性腺激素对动物的生殖以及相关性行为的发生进行生物应答，以调节机体的生殖功能[4]。家禽遭受热应激时，机体的组织器官直接受到损害，并发生生理和病理变化，而所有生物机体在遭受应激刺激时(如高热、感染、缺血、缺氧及化学物质等)，其组织细胞均能迅速产生一类高度保守的保护性蛋白——热休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)，它可以抵抗因过度应激所造成的组织细胞损伤，HSPs作为分子伴侣，具有识别细胞氧化还原反应的功能，它能与未折叠或错误折叠的蛋白结合并促使这些问题蛋白恢复正常状态[5]。相关研究表明，HSPs与高温环境下细胞发育、激素调节、精子生成及排卵等生命过程的稳定密切相关[6-9]。

1 热应激对家禽HPG轴组织发育的影响

热应激引起鸡的HPG轴组织结构损伤，破坏组织完整性，导致相关细胞结构疏松、数量减少、凋亡甚至坏死、细胞器脱落、细胞核染色质减少聚集等，严重阻碍雏鸡生殖器官及生殖细胞的生长发育，抑制精子的发生和成熟，造成生殖功能减退，最终影响家禽的正常发育和繁殖[2-3,10-11]。

1.1 热应激对家禽下丘脑组织发育的影响

下丘脑内的视上核(SON)和室旁核(PVN)两个重要核团不仅能够参与机体内水盐平衡、血压稳定、生殖机能等活动，还能调节各种应激反应。当环境温度达到42 ℃时，会导致SON 和PVN的神经元甚至脑内所有相关部位的神经元受到损伤[12]。热应激导致文昌鸡雏鸡的下丘脑组织重量、单位面积神经元的数目、胞体横截面积及分布密度下降，神经元胞体染色变浅，部分神经元发生病变等明显的应激损伤，对生长发育关键期和温度敏感期的雏鸡造成一定的影响[2-3]，而2周龄前的热应激雏鸡神经元胞体面积及其分布密度均高于对照组，说明适宜的高温环境可能有利于雏鸡的生长发育[13]。

1.2 热应激对家禽垂体组织发育的影响

垂体是动物体内重要的内分泌腺，是下丘脑与外周器官之间生理信号交换的中间器官，是发育、应激和其他生理过程中稳定机体平衡的关键调节器。雏鸡在遭受(40±0.5)℃的高温应激后，垂体组织结构不完整，细胞间隙明显增大，组织重量、细胞整体数目、嗜酸细胞、嗜碱细胞及嫌色细胞的分布密度下降，表现出明显的应激损伤，说明热应激抑制垂体的正常发育[2,14]。腺垂体中的嗜酸细胞可以分泌生长激素和催乳素，嗜碱细胞可分泌卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)，而热应激使嗜酸、嗜碱细胞分布密度下降所导致的生长激素和性腺激素等合成分泌减少，推迟雄性动物性成熟，从而阻碍家禽生长和繁殖[15]。

1.3 热应激对家禽卵巢组织发育的影响

热应激使蛋鸡卵巢重量、优势卵泡指数、优势卵泡和小黄卵泡数量明显减少，而优势卵泡是对FSH反应快、效应强的卵泡，可以继续生长发育，其他卵泡则退化闭锁[16]，在禽类卵泡发育中FSH的作用是诱导黄体生成素受体(LHR)形成和颗粒细胞分化，促进卵泡发育并使其进入排卵前的等级状态[17]，因此高温对蛋鸡生产性能的影响可能是对卵巢产生的直接影响，并致使卵巢的血流量减少，卵泡发育受到抑制，从而导致卵巢重量降低，直至卵泡发育停止[18]。另外，热应激文昌鸡雏鸡在5周龄时卵巢的各级卵泡细胞直径低于正常雏鸡，卵巢重下降，卵泡发育迟缓；第 5、6 周龄时，热应激组雏鸡各级卵泡细胞分布密度较正常组相比有所增加，可能是由于机体原有的卵泡细胞遭受热应激损伤后，需要分化出更多新的卵泡细胞来维持机体生长发育活动的正常进行，这是机体器官功能下降时自身引发的代偿作用，以维持机体的稳态平衡[14]。

1.4 热应激对家禽睾丸组织发育的影响

热应激条件下鹌鹑睾丸组织中精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子等所有生精细胞的数量均显著减少[19]，热应激导致文昌鸡雏鸡睾丸组织发生异常变化，通过对组织切片的观察发现，与对照组相比，热应激组雏鸡的睾丸碎裂程度更高，完整性显著降低，曲细精管基膜较薄，管腔空旷，直径和横截面积增长趋势降低；生精上皮变薄，高度增长缓慢，生殖上皮细胞、生精细胞、支持细胞、生殖细胞数量及生殖细胞层数减少且排列松散无序，液泡发生异常变化，胞核浓缩、深染等现象[2-3]，而支持细胞的数量和功能状态决定睾丸大小和精子发生的正常进行，且幼年时期支持细胞的变化会直接影响成年后睾丸大小和精子质量[17]，由此说明热应激诱导曲细精管萎缩并严重影响了雏鸡睾丸组织和细胞的生长及精子发生等正常的生殖功能。

2 热应激对家禽HPG轴生殖内分泌及繁殖功能的影响

2.1 热应激对HPG轴激素分泌的影响

而家禽为了抵抗高温高湿环境引起的热应激反应会通过释放HPG轴上的激素来调节自身的免疫和繁殖。HPG轴是一个协调的神经内分泌系统，它主要通过下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH)刺激垂体分泌FSH和LH，进而促进性激素分泌和性腺发育，其中LH能刺激睾丸间质细胞合成分泌睾酮(T)，FSH则能促进曲细精管的成熟和调控精子生成，LH和FSH再进一步作用促进T的分泌合成，或通过对卵巢细胞和颗粒细胞的协调作用促进雌二醇(E2)的生成[20-22]。此外，下丘脑分泌的其他激素，包括促性腺激素抑制激素(GnIH)、血管活性肠肽(VIP)和神经肽Y(NPY)，也可以通过调节垂体激素分泌来促进性腺发育和性激素的产生[23]。

2.2 热应激对雌禽内分泌的影响

研究表明，热应激2 d后鸡的血浆孕酮(P)和T含量显著降低，热应激14 d后血浆17β-E2明显减少，短期和长期热应激导致细胞色素P450芳香酶和17-α羟化酶的mRNA的表达显著降低，而在整个热应激过程中血浆LH、FSH水平均无显著变化，因此认为热应激可能对卵巢功能有直接的影响[18]。此外，热应激导致下丘脑促性腺激素减少，降低血液中P和E2的含量，导致排卵数减少，排卵率降低，并使卵子在输卵管转运间隔延长，最终降低产蛋率[24]。在卵巢中FSH和LH分别与促卵泡生成素受体(FSHR)和LHR结合，以调节卵泡的生长发育；通过产生甾类激素，促进卵泡颗粒细胞中P的合成，促使鸡的卵泡膜大量增多，并通过诱导排卵来提高鸡的产蛋量[25]。热应激蛋鸡的内分泌失调，表现为下丘脑GnRH分泌减少，进而减少垂体促性腺激素(GTH)生成，并导致LH与FSH含量降低[24]，而LH分泌减少会导致卵泡发育的受阻及排卵的抑制，同时也会降低优势卵泡分泌雌激素的水平，导致发情不明显及卵泡质量降低，甚至排卵失败[26]。

2.3 热应激对雄禽内分泌的影响

在睾丸发育过程中，LH和FSH促进生精上皮的发育和精原细胞的增殖，FSH和LH经受体对雄激素进行间接调节以保证睾丸正常T浓度和维持正常的生精功能。热应激显著降低LHR和FSHRmRNA的表达[27]，在雄禽中，高温使垂体FSH和LH及其受体减少，导致精母细胞增殖减缓和T的合成降低，严重影响精子发生、精子活力、顶体完整性和受精过程，降低动物繁殖的成功率，最终导致生殖能力下降[26-28]，同时，热应激严重影响文昌鸡雏鸡睾丸间质细胞的发育，阻碍生殖器官正常的生长发育[2]。

2.4 热应激对家禽繁殖功能的影响

禽类的催乳素(PRL)浓度与繁殖有关，PRL水平在热应激反应中的增加被认为是导致生殖障碍的一个因素[29]。研究发现，高温终止火鸡的产卵、诱导卵巢退化、降低血浆LH和卵巢类固醇水平，增加血浆PRL水平，导致产蛋期缩短[30]。已知高浓度的PRL通过作用于下丘脑抑制GnRH的释放，降低垂体LH-β亚基mRNA表达和LH释放，导致生殖活性下降，延迟性成熟的发生[31]；对高温环境的火鸡进行下丘脑VIP免疫或口服5-羟色胺(5-HT)生物合成抑制剂——对氯代苯丙氨酸(PCPA)处理发现，两种方式均能降低循环PRL水平，且经PCPA处理后，热应激火鸡血浆LH和卵巢类固醇水平恢复到正常水平，但VIP免疫没有达到恢复的效果，因此，该研究认为，高温对繁殖性能的不利影响可能与热应激鸟类的PRL水平升高无关，而是与涉及5-HT神经传递和热应激诱导的机制有关，更值得注意的是，当PCPA施用于VIP免疫的火鸡时，其在热应激火鸡中维持产蛋的有效性显著下降[30]。Avitalcohen等[32]研究表明,对老年的火鸡进行下丘脑VIP免疫或口服PCPA，均可以降低PRL水平且显著增加睾丸重量、精液量、精子浓度和射精等级，血浆T水平以及GnRH-1，FSH和LH基因的表达。此外，与对照组相比，在PCPA和VIP免疫的试验鸡中观察到血浆E2和PRL浓度以及VIP和PRL基因表达的降低，且所有PRL施药组的性腺轴功能和精液质量均下降，因此认为5-HT的表达水平增加会抑制正常的性腺功能和繁殖性能;但PCPA和VIP对高温抑制产卵活动的差异机制尚不清楚，即产卵终止、PRL水平和高温热应激之间存在密切且复杂的关系。

3 热休克蛋白在热应激家禽HPG轴中的作用

在动物HPG轴各组织中，HSPs从不同水平参与相应生殖调节活动，并发挥其特有的生理功能。

3.1 HSPs与激素调节

在激素调节水平上，位于细胞浆中的糖皮质激素、盐皮质激素受体和位于细胞核中的雄激素、雌激素及孕激素受体, 在未被活化时都与HSP90结合[33]。Rajapandi等研究发现，HSP70和HSP90都能直接且单独与糖皮质激素受体(GR)结合，并且这两种蛋白质的结合足以重新激活解离的受体活性，使其与类固醇激素相结合，发挥相应的生理作用[34]。热应激刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴，导致糖皮质激素(GC)分泌量升高，从而提高机体对高温刺激的适应能力[35]，而高浓度的GC影响HPG轴分泌的GnRH、FSH、LH、T和E2等激素的生成以及排卵等生命活动[36]，且GC要发挥作用，必须首先与靶细胞内特异的GR结合[37-39]。王选年等[6]研究表示，热应激(4 h、40 ℃)伊萨公雏鸡GR的结合容量下降，HSP90大量合成来调节并维持激素与受体的结合，而GR具有α和β两个亚型，GRβ存在于胞核，不具有与配体结合的能力；GRα存在于胞浆，可以通过核转位从胞浆转移到胞核，具有结合DNA发挥基因调控的功能[40]，在热应激前后随着HSP90 mRNA表达的增加，GRmRNA的表达量也增加，而胞浆中增加的HSP90又促进了GRα的核转位(GRα/GRβ增加)[35]，因此HSP90可能在一定程度上决定了GR的功能状态，并决定组织对GC的敏感性[41]。

3.2 HSPs在HPG轴蛋白水平的表达

在蛋白水平上，HSP60在下丘脑的室旁核细胞、垂体的腺细胞、睾丸精原细胞和精母细胞中有高表达，因此，推测HSP60可能与神经元的保护、垂体的激素分泌、精子生成密切相关[9]。急性热应激对性成熟后的雄性生殖系统造成损伤，HSP70在睾丸、附睾、输精管中的表达与定位具有区域特异性和细胞特异性, 提示其可能参与精子的发生与成熟过程，且HSP70在热应激状态下蛋白表达量大幅上升[42]，而慢性热应激海兰褐蛋鸡卵巢HSP70蛋白含量随时间变化呈现先降低后持续升高的变化趋势[8]，推测HSPs具有参与保护生殖器官免受高热损伤的作用。成年鸡睾丸雄性生殖细胞暴露于高温后，HSP70的转录和多聚腺苷酸化均增加，但此变化在小鼠睾丸细胞中没有发生，表明禽类和哺乳动物睾丸生殖细胞在热应激诱导和HSP70的转录在多聚腺苷酸化方面存在显著差异，而多聚腺苷酸化在调节HSP70表达中起关键作用[43]，因此HSPs可能具有提高禽类精子发生过程中必需蛋白的合成并获得耐热性的作用。

3.3 HSPs在HPG轴核酸水平的表达

在核酸水平上，急性热应激使鸭的垂体及下丘脑中HSP70 mRNA表达水平显著升高，可能是由于高温环境使细胞代谢加快，加剧HSP70的消耗，也可能是通过HSP70的增加，对细胞起到保护作用[44]。热应激影响肉鸡下丘脑中HSP家族转录组的表达，尤其使HSPCB(HSP90)和DNACJ13(HSP40)两种HSPs基因的表达差异显著，DNAJC13的表达上调而HSPCB的表达下调，表明热应激会对机体产生较大的损伤，并且机体可以积极地产生各种机制来抵抗热应激[45]。阮炜珊等[11]研究表明，在热应激岭南黄鸡雏鸡法氏囊和脾脏损伤最为严重的第21～28 d，细胞中HSP27 mRNA表达量明显高于其他日龄, 从而验证细胞中HSP27转录的增多可保护动物机体免受热应激的损伤，而小热休克蛋白(sHSP)αβ-晶状体蛋白在大鼠心肌细胞热应激模型中的表达呈下降趋势，并且有从细胞浆向细胞核移位的现象，其与细胞骨架蛋白的共定位显示sHSP具有参与细胞骨架的保护作用[46]。

经微阵列分析发现，在热应激下，鸡的睾丸HSP25，HSP70和HSP90AA1 mRNA及Bcl-3结合抗凋亡基因的表达量升高，表明HSPs可以保护睾丸细胞免受高温刺激，保证精子发生以发挥正常生理作用，并推断HSP25可能在鸡的急性热应激反应中发挥独特而重要的作用[7]。更早的研究表明，只有禽类HSP25主要积累在由蛋白酶体抑制诱导的聚集体中，鸡睾丸HSP25(cHSP25)的分子克隆显示其属于HSP30家族，是αβ-晶状体蛋白/sHSP基因家族的亚家族，cHSP25过表达促进了聚集体的形成，但小鼠睾丸和卵巢HSP27过表达没有这种现象发生[47]，而在鹌鹑成纤维细胞中，HSP25的蛋白积累促进了聚集体的解离[48]，因此认为禽类HSP25与蛋白质聚集体上的其他sHSP的作用不同。

热应激后，机体能够快速合成 HSPs，意味着家禽体内具有自我保护功能，说明在热应激条件下HSPs的变化具有指导家禽养殖的意义。HSPs在热应激动物HPG轴各组织中的表达与相应功能的关系十分密切，且禽类和哺乳类之间热休克蛋白在HPG轴上的表达和发挥的具体功能存在一定差异。

4 展 望

综上所述，热应激引起家禽HPG轴中各组织结构不同程度的损伤，阻碍家禽生殖器官及其相关功能细胞的发育，严重影响家禽繁殖性能。热应激导致家禽HPG轴各组织中HSPs的表达发生变化，研究家禽HPG轴各组织中不同HSPs的表达情况及其作用，有助于明确家禽HPG轴中HSPs表达的变化规律及其作用机制，为缓解家禽热应激方面的研究和发展提供导向，也有助于在家禽养殖业和兽医学中发现新的功能和应用方向。另外，热应激条件下，下丘脑-垂体-性腺轴中HSPs的研究多集中在哺乳动物，如牛、鼠等，而在禽类中的研究仍不全面，存在“HSP家族在热应激禽类HPG轴各组织中的表达差异？是否具有功能相关性？与哺乳类HSPs发挥的具体生物学功能是否有所差别？”等问题。因此，热应激状态下HSPs在家禽HPG轴中的表达及在机体内发挥的作用与具体机制亟需更进一步的研究。