葛花异黄酮检验方法研究

宋 笛

（长春职业技术学院食品与生物学院，吉林 长春 130033）

1 葛花的药用价值

葛花，中药名又称葛根花, 属豆科植物野葛Pueraria lobate（Willd.）Ohwi，也可将其视为甘葛藤Pueraria thomsonii Benth的干燥[1]花蕾。野葛除新疆、西藏外，广泛分布于全国各地。甘葛藤则多分布于四川、云南、广东、广西等地，常生长或被栽培于较阴湿的山坡草丛中或灌木丛中。野葛花花冠为蓝紫色或紫色，甘葛藤的花又叫粉葛花，花冠呈紫色或灰紫色，久置过后变为黄白色至深黄色。两种花均无臭，味淡，可入药或作为花草茶饮用。

其功效大致有以下几种：①解酒护肝。治疗烦热口渴，头痛头晕，饱胀呕吐，反流酸水等伤酒之症；②清热解毒。治疗感冒发热、小儿腹泻、急性胃肠炎、突发性耳聋等疾病；③调节内分泌。葛花能调节人体机能，增强体质，提高机体抗病能力，抗衰延年；④其他功效。固齿强骨，预防蛀牙、增强儿童发育和智力。对缓解高血压、冠心病、心绞痛有一定作用。

葛花的这些营养保健及药用价值，归功于其富含葛花素、大豆黄酮、花生素、多种氨基酸等成分。而且还含有丰富的铜、硒、钙、铁、铜、硒等矿物质。作为一种药食同源的植物，很早便在《神农本草经》《千金方》《本草纲目》中有所记载。

2 葛花的研究现状

随着葛根功效被熟知，许多专业从事葛根栽培和葛根产品开发的公司如雨后春笋般出现。粉用葛根的品种选育、种植基地、食品加工方面的进步，带动了葛根及葛花的药理研究、成分提取、新药开发。随着葛花中越来越多的化学成分被检出，其新的药理活性领域也在不断扩大。根据现代研究结果可知，葛根内部含有量最大的物质为黄酮类化合物，其余物质包括挥发油、皂苷、甾醇、挥发油、氨基酸，其中黄酮类化合物在葛根葛花中表现突出，如鸢尾苷（tectoridin）、尼泊尔鸢尾素（irisolidone）、鸢尾黄素（tectorigenin）、6'-O- 木 糖 鸢 尾 苷（6'-O-xylo -syl -tectoridin)；刺槐素（robinin）、芒柄花素（formomonetin）、染料木素（genistein)、黄豆黄素（glycitein）、大豆黄素（daidzein)、槲皮素（quercetin)；葛花亭（kakkatin）、芦丁（rutin）、葛花苷（kakkalide）、鹰嘴豆素甲（biocanin A）、芒柄花苷（ononin）、烟花苷（nicotiflorin）、黄豆黄苷（glycitin）、6'-O- 木糖黄豆苷（6'-O-xylosy -glycitin）[2]。

其中，葛花苷和鸢尾苷在葛花中的含量较高，是葛花异黄酮的代表性成分[3]。张淑萍等[4]采用反相高效液相色谱法测定了葛花中3 种异黄酮（葛花苷、次葛花苷和尼泊尔鸢尾异黄酮三种异黄酮）的含量，分别为3.33%、0.22%和0.32%。

目前，葛花异黄酮的提取工艺常见于文献的有色谱法、溶液法等。

2.1 色谱法

尹俊亭[5-6]在葛花提取物分离、纯化、重结晶操作使用了硅胶柱色谱，分离结果可知，葛花可提取出尼泊尔鸢尾异黄酮7-O-β-D- 葡萄糖苷、染料木苷（genistin）等物质。张淑萍等[7]使用色谱、光谱、理化相结合的方法对葛花进行分离提取，得到了刺芒柄花素（formononetin）、尼泊尔鸢尾异黄酮、大豆苷元、8- C- 芹菜糖塘（1→6）- 葡萄糖- 大豆苷等物质。裴香萍[8]是第一位使用聚酰胺柱色谱法提取出葛花醇提物内7- 甲氧基香豆素的学者。张杰等[9]曾使用羟丙基葡聚糖凝胶及硅胶色谱柱方法对葛花进行了分离提取，第一次从葛花中获取了5，6，7，4'- 四羟基异黄酮- 6，7- 二葡萄糖苷物质。

2.2 溶液法

葛花提取物提取最常用的溶剂为乙醇，在提取过程中浸提时间、浸提温度、固液比、乙醇浓度、回流时间等因素[10]对葛花异黄酮提取率有很大的影响[11-12]。

为了优化异黄酮的提取工艺，张永丹[13]、冯维希[14]等使用正丁醇/水体系，王瑶[15]等使用乙醇/乙酸乙酯体系，提取葛花中的异黄酮，并发现选用乙醇溶液提取的产率有所提高。吴桐等以乙酸乙酯/乙醇/水（体积比为4.0∶0.5∶3.0）组成三元溶剂体系，从葛根粗提物200 mg 中提取葛根素2.36 mg，鸢尾苷8.57 mg，染料木黄酮5.34 mg，经高效液相色谱分析其纯度均达到90.0%以上，为葛花中异黄酮类活性化合物的分离纯化提供了新途径[16]。

其他试剂如水、甲醇[17]等，也在文献中有记录过。汪新亮提出，以甲醇为溶剂的索氏提取仪提取和热水浸提相结合的提取方法提取的葛花总异黄酮和鸢尾异黄酮产量均为最高,鸢尾异黄酮破坏较少。甲醇中索氏提取仪提取和水浸提相结合的提取方法为葛花中鸢尾异黄酮最佳提取方法[18]。

2.3 其他辅助方式

随着现代仪器的发展，超声波促融[19-20]越来越多地应用到葛花黄酮提取的工艺流程中。代明君用超声波技术促进葛花异黄酮的提取，发现各因素对葛花黄酮得率的影响程度为料液比>乙醇浓度>超声功率>超声时间。在此基础上，他用高压脉冲电场法提取葛花黄酮，在乙醇浓度60%，料液比1∶32，电场强度16 kv/cm，脉冲数8 个，此时黄酮得率为10.37%，得率高于超声波法提取葛花黄酮[21]。

3 检验方法

目前，葛花提取物分离的常规检验方法如UV 法、可见分光光度法及HPLC 法多见于文献。

3.1 UV 法（中国药典2005 年版I 部，附录VA）[22]

3.1.1 对照品溶液的制备

精密称取20.8 mg 鸢尾苷对照品，于60℃干燥至恒重，加入乙醇制成208 μg/mL 的溶液作为对照品溶液。

3.1.2 供样品溶液的制备

取过3 号筛且干燥至恒重的葛花药材粉末约0.3 g，精密称定，置100 mL 带塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，关合，称重，加热回流提取2 h，冷却，再次称重，用60%乙醇补减量，摇匀，过滤，精密吸取滤液0.1 mL，放入10 mL 容量瓶内加入乙醇至标准刻度，最后摇匀既可。

3.1.3 标准曲线制备

精密量取对照品溶液0.25 mL，0.5 mL，0.75 mL，1.0 mL，1.25 mL 分别于25 mL 量瓶中，加60%乙醇至刻度。空白溶液为乙醇溶液，观察波长状况，达到265 波长后对吸光度进行测定，根据测定结果设吸光度、浓度分别为纵横乙醇溶液为空白，在265 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标、绘坐标可得标准曲线。

3.1.4 测定法

依照供样品溶液照标准曲线制备项下方法, 对吸光度进行测定，结合标准曲线可知样品溶液内鸢尾苷质量（μg），计算结果，即得。

3.2 可见分光光度法[23]

对照品溶液和供样品溶液的制备。准确称取适量芦丁，溶于80%乙醇中，制成12.32 μg/mL 的对照溶液。

葛根用去离子水漂洗3 次，60℃干燥后压碎，准确称取葛根花药粉2 g，放入索氏提取液中，用乙醚脱脂2 h 至提取物无色，蒸干乙醚，残渣用95%乙醇浸泡5 h，索氏提取4 h，直至提取物无色。滤液用95%乙醇在50 mL 容量瓶中稀释，以制备供样品溶液。

总黄酮测定方法。精密吸取供样品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.30 mL，摇匀，放置6 min，加入10% Al（NO3）2。溶 液0.30mL，摇 匀，再 放 置6 min，加 入4 %NaOH 4.00 mL，加蒸馏水稀释至10.00 mL，摇匀，放置10 min，同法做空白，于506 nm 处测定吸光度。

3.3 HPLC 法[24]

称取50 mg 葛花提取物、12.5 mg 的纯化物，使用80%甲醇通过超声溶解方式置入容量瓶，定容50 mL，摇晃均匀让微孔滤膜进行过滤，可取得10μL 续滤液，后将续滤液注入高效液相色谱仪内进行分析。随后在高效液相色谱仪分析过程中，对峰面积进行记录，采用外标法对葛花提取物内鸢尾苷、6"-O- 木糖鸢尾、染料木素含量进行计算，最后将计算结果与鸢尾苷标准品峰面积进行百分比计算既可。

4 小结

（1）高效液相色谱与紫外分光光度法联合可用于葛根的质量评价和提取工艺的确定。两种方法综合评价最佳提取工艺,其结果更为科学合理。

（2）鸢尾苷、6"-O- 木糖鸢尾苷、染料木素3 种主要黄酮类成分的含量,可作为葛花质量评价的指标物质。

（3）随着检验技术的发展，一些精密检验方法，如超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/Ms）也可以应用到葛花提取物分离中[25]。