同型半胱氨酸修饰甲基-CpG结合蛋白2与自闭症谱系障碍相关

王晔阳 赵健元

近年来，自闭症谱系障碍(ASD)的发病率呈现持续上升的趋势[1]。ASD的生物学基础复杂。有研究报道，ASD患者的同型半胱氨酸(Hcy)水平在幼年和成年阶段均显著高于正常范围[2, 3]。本课题组前期研究发现，异常激活的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)将Hcy错误编辑为高能同型半胱氨酸硫代内酯(HTL)，对相关蛋白形成N-Hcy修饰，从而使蛋白功能受到影响[4]。本文通过研究受N-Hcy修饰影响的蛋白及其功能改变，进一步探讨ASD的潜在发生机制。

1 方法

1.1 人体样本来源 ASD患儿和对照组儿童外周血cDNA样本来自本课题组前期研究[5]。

1.2 细胞株和动物来源 人胚肾上皮细胞系HEK-293T和小鼠神经干细胞NE-4C细胞系均来自中科院典型培养物保藏委员会细胞库，小鼠海马神经元细胞系HT22来自中国微生物菌种查询网，野生型C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.3 实时荧光定量PCR 将NE-4C细胞用不同浓度梯度(0、0.25、0.50、1.00 mmol·L-1)Hcy处理25 h，抽提细胞RNA并行反转录(诺唯赞公司反转录试剂盒)。以β-actin和GAPDH作为内参，利用在线软件PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)设计MARS、GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因的引物，用荧光定量PCR试剂盒(诺唯赞公司)进行检测。

1.4 串联亲和纯化法 检测MARS互作蛋白的TAP法参考本课题组前期研究[6]。

1.5 免疫沉淀 为检测Hcy对MeCP2的修饰，将NE-4C细胞用4 mmol·L-1Hcy处理，收集细胞裂解液，加入碘乙酰胺保护巯基，取上清并与MeCP2抗体(Abcam公司，货号ab2828)和G蛋白孵育，沉淀后收集Hcy处理的MeCP2蛋白，一部分经胰酶酶切、干燥后用于液相质谱实验，一部分用于蛋白质免疫印迹实验，检测MeCP2的Hcy修饰情况。Hcy修饰抗体为实验室自制[6]。

1.6 凝胶迁移实验(EMSA) 为检测Hcy修饰对MeCP2功能的影响，用带羧基荧光素(FAM)标签的甲基化、非甲基化DNA和 MeCP2、HTL(0、1、4 mmol·L-1)互作，反应后用于DNA印迹实验。

1.7 染色质免疫共沉淀(ChIP) 为检测Hcy修饰对MeCP2转录调控功能的影响，分别用Hcy、过表达MARS处理HEK293T细胞，收集细胞裂解液用于ChIP实验;并以高浓度Hcy饲料饲喂C57BL/6J小鼠，取脑组织用于ChIP实验。

1.8 统计学方法 实验结果采用双尾非配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASD患儿血液MARS转录水平升高 实时荧光定量PCR(图1A)显示，ASD组外周血cDNA中MARS水平高于对照组(P<0.01)。串联亲和纯化法检测发现，MeCP2是与MARS存在互作关系的转录因子。

2.2 Hcy自发修饰MeCP2并抑制其活性 免疫沉淀结果(图1B)显示，NE-4C细胞内MeCP2能够被Hcy自发修饰。液相质谱(图1C)检测到7个可能被Hcy修饰的赖氨酸残基位点，其中K82、K130在甲基CpG结合结构域(MBD)，K271在转录抑制域(TRD)。

图1 ASD患儿血液MARS转录水平以及Hcy自发修饰MeCP2

EMSA结果(图2A)显示，MeCP2发生HTL化后，其与DNA甲基化CpG结构域的结合能力受到明显抑制。

用受MeCP2转录调控的BDNF和GRIN2A基因的启动子进行ChIP实验。图2B显示，HEK293T细胞过表达MARS或用Hcy处理后，与MeCP2互作的靶基因启动子均显著减少，且共同处理有加和作用；高浓度Hcy饲料喂养后，小鼠脑组织MeCP2与BDNF和GRIN2A基因启动子共沉淀显著减少。

实时荧光定量PCR结果(图2C)显示，在NE-4C和HT22细胞株中，分别用不同浓度梯度Hcy处理，GRIN2A、BDNF转录水平均显著高于对照组。

2.3 ASD患儿血液中MeCP2下游基因的转录水平异常 实时荧光定量PCR在对照组和ASD组各检测了14个cDNA样本，42.9%ASD患儿 中GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因转录水平高于对照组均值；ASD患儿EAAT2、EAAT4基因平均转录水平高于对照组，差异有统计学意义；在分析样本中(n=28)GRIN2A和BDNF转录水平正相关(r=0.984，t=39.667)。高转录EAAT1～4的ASD患儿中GRIN2A、BDNF转录水平亦较高。

图2 N-Hcy抑制MeCP2活性

3 讨论

有研究显示，血清高浓度Hcy可作为早期临床诊断ASD的生物标志物，也是叶酸依赖性甲硫氨酸循环受损的指标[7]。Hcy在MARS的催化下错误编辑为HTL[8]。HTL可自发修饰到蛋白质的高能赖氨酸残基上，影响蛋白质功能而致病[4]。MeCP2是作用于神经发育基因(如BDNF、GRIN2A)的转录调控因子[9]，对新生儿大脑发育起重要表观遗传调控作用。在许多神经发育障碍中均检测到MeCP2基因的拷贝数变异和突变[10]。研究报道，在ASD患儿大脑皮质中MeCP2表达水平常降低[9]。

本研究发现，高MARS表达水平和Hcy浓度使 MeCP2被HTL修饰，共价赖氨酸-Hcy化形成MeCP2-K-Hcy，被修饰的MeCP2蛋白与DNA甲基化CpG的结合活性降低，从而影响MeCP2下游神经发育基因的转录水平，使GRIN2A、BDNF等的转录水平增加。由此认为，MeCP2在无突变的情况下被表观遗传修饰的程度，即Hcy对MeCP2的修饰水平和MARS表达异常可能是部分神经发育疾病(如ASD)的关键致病因素。

本研究从体内修饰机制和患儿样本检测2方面探究高K-Hcy浓度与个体患ASD的可能联系，发现ASD患儿MeCP2下游基因转录调控异常可能与Hcy对MeCP2的修饰相关，且ASD患儿血液中MARS表达水平显著升高。此外，ASD患儿中存在一个群体，其GRIN2A、BDNF、EAATs等受MeCP2蛋白调控的靶基因为高转录水平，可能指向ASD中尚未分类的某种神经发育疾病。