鸦胆子不同极性部位抑制ras突变的肿瘤活性谱效关系研究△

任伟钰，马天翔，包靖靖，郑宜鋆，王亚丽，3，刘东玲，3*，顾志荣*

1.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院 药剂科，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000

鸦胆子为苦木科鸦胆子属植物Bruceajavanica(L.)Merr.的干燥成熟果实，又名老鸦胆、苦参子、小苦楝等，味苦，性寒，有小毒，具有清热解毒、燥湿杀虫、止痢截疟的功效。目前从鸦胆子中分离鉴定了苦木内酯及其苷类、类苦木素类、生物碱类、黄酮苷类等成分，这些成分具有抗炎、抗菌、抗疟、抗肿瘤等广泛的药理作用[1]。研究发现，鸦胆子苦醇对黑色素瘤B-16、白血病L-1210及P-388等细胞有明显的抑制效果，鸦胆子苦苷A、B和鸦胆子素E、F均具有明显的抗腹水肿瘤及Walker氏癌肉瘤256瘤株的活性，鸦胆因D还具有抗炎、抗疟的作用[2]。研究发现，大约30%的人类肿瘤存在ras基因突变，且多种肿瘤均检测到p21ras过表达，表明ras基因突变和p21ras过表达确与恶性肿瘤发生有关[3]。因此，开发能抑制人类肿瘤中ras基因突变的药物是众多研究人员广泛关注的问题。

有研究表明，苦木内酯类化合物鸦胆苦醇、鸦胆因D、鸦胆因A、鸦胆丁醇有抗肿瘤作用[4]，但鸦胆子化学成分种类较多，活性成分极为丰富，因此按不同极性或提取部位进行研究，对于全面深入阐释鸦胆子抗肿瘤活性及其物质基础具有积极意义。因此，本实验参照文献方法，采用不同有机溶剂提取鸦胆子，得到不同极性部位，探究不同部位提取物抑制ras突变肿瘤活性的谱效关系，为阐释其抗肿瘤作用及物质基础提供参考[1，5]。

1 材料

1.1 线虫、菌株

1.2 试药

鸦胆子购于兰州市黄河药材市场，经甘肃中医药大学药学院晋玲教授鉴定为苦木科鸦胆子B.jauanica(L.) Merr.的干燥成熟果实；对照品鸦胆子苦醇(批号：112586，纯度：97%，上海同田生物技术股份有限公司)；二甲基亚砜(DMSO，上海中秦化学试剂有限公司)；石油醚(30～60 ℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇，均为分析纯(天津市百世化工有限公司)；甲醇为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；水为二次蒸馏水；LB液体培养基、LB固体培养基、NGM培养基、M9缓冲液、裂解液、S缓冲液、柠檬酸缓冲液均为实验室配制。

1.3 仪器

Agilent 1260型Infinity液相色谱仪(美国安捷伦公司)；DL-180型超声波清洗器(浙江象山县石蒲海天电子仪器厂)；AF10O4N型万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；GFL3033型气浴恒温摇床(北京博励行仪器公司)；B2型生物安全柜(美国Thermo Fisher公司)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；THZ-82型摇床(金坛市恒丰仪器厂)；GR60DR型灭菌锅(厦门仪器厂)；浮游生物计数板(北京普利特仪器有限公司)；SQP型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 鸦胆子不同极性部位提取

2.1.1预处理 鸦胆子置于干燥箱中，于80 ℃恒温干燥2 h至恒定质量，待其冷却，用粉碎机粉碎，得鸦胆子粉(过100目筛)。精密称取药粉500 g，按药粉-石油醚1∶6浸泡2次，每次24 h，合并滤液，滤渣80 ℃烘干，冷却，得脱脂鸦胆子粉，冷藏备用。

2.1.2不同极性部位提取 将脱脂鸦胆子粉加入至95%乙醇中，鸦胆子粉与乙醇为7∶1，60 ℃回流提取2次，每次2 h，得到苦味浸膏，依次用三氯甲烷及乙酸乙酯萃取，回收溶剂，干燥。分别得到三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位以及残余部位，备用。

2.2 鸦胆子不同部位HPLC特征图谱建立

2.2.1色谱条件 安捷伦z0RBAx ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相甲醇(A)-水(B)梯度洗脱(0～7 min，20%～60%A；7～18 min，60%～80%A；18～22 min，80%～20%A)，柱温25 ℃，检测波长277 nm，体积流量1.0 mL·min-1，进样量20 μL[6]。

2.2.2供试品溶液制备 精密称取三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、残余部位粉末0.051 1、0.050 2、0.051 4 g，分别置于25 mL量瓶中，加入甲醇，超声辅助使完全溶解，定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样。

2.2.3方法学考察 按照《中华人民共和国药典》2015年版[7]方法考察稳定性、重复性、精密度、加样回收率，RSD均小于3.0%，符合要求。

2.2.4不同萃取部位HPLC特征图谱建立 按照2.2.1项下色谱条件，建立不同部位HPLC特征图谱，见图1。特征峰峰面积见表1。可知，不同部位的共有色谱峰有17个，其中三氯甲烷部位有12个，乙酸乙酯部位及残余部位各有13个。经对照品比对，确认14号峰为鸦胆子苦醇。对比不同极性部位色谱图，发现各部分化学成分及含量存在较大差异。

新兴的近代慈善事业实际上是近代城市慈善事业，是“以近代城市的兴起为依托、为载体的”[1]55。慈善义演作为近代慈善事业的重要活动形式之一，与近代都市文化的发展具有密不可分的联系，它产生于都市，并发展于社会近代化和城市化过程之中，而并非乡村地区，这是慈善义演作为近代慈善事业的表现形式的重要标志。从慈善义演的形式看，它是通过艺人演出的方式筹集资金来进行慈善救助的行为，而这种演出的形式，则是多种多样，但是从根本上说，艺术演出这种行为本身，便是要满足具有近代意义的都市社会的娱乐需要。首先，作为一种常规的筹募方式，一种普遍存在的慈善救助形式，它的发起要具备三个基本条件：

表1 不同部位HPLC特征峰峰面积

注：1～17表示特征峰；A.三氯甲烷部位；B.乙酸乙酯部位；C.残余部位。图1 三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和残余部位色谱图

2.3 鸦胆子不同部位对秀丽隐杆线虫的急性毒性实验

2.3.1培养基及溶液配制 LB液体培养基：1 L培养基中加入蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g，并用1 mol·L-1的NaOH溶液调pH至7.0，121 ℃温度下灭菌20 min；LB固体培养基：LB液体培养基高压灭菌前加入细菌琼脂粉15 g·L-1，121 ℃，灭菌15 min；NGM培养基：1 L培养基中加入NaCl 3 g、蛋白胨2.5 g、琼脂17 g、1 mol·L-1K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH=6.0) 25 mL、蒸馏水975 mL，灭菌后加入滤过除菌的5 mg·mL-1胆固醇溶液、1 mol·L-1MgSO4溶液、1 mol·L-1CaCl2溶液各1 mL；M9缓冲液：1 L缓冲液中含Na2HPO4·12H2O 15 g、KH2PO43 g、NaCl 5 g、Mg2SO4·7H2O 0.25 g；裂解液：6.4% NaClO溶液和1 mol·L-1NaOH溶液按1∶1混合；S缓冲液：1 L蒸馏水中加入NaCl 5.85 g、K2HPO41 g、KH2PO46 g，混匀，灭菌，制成S基础液，1 L S基础液加入柠檬酸缓冲液10 mL、Trace液10 mL、5 mg·mL-1胆固醇1 mL、1 mol·L-1MgSO43 mL、1 mol·L-1CaCl2溶液3 mL，混匀；柠檬酸缓冲液：柠檬酸20 g、柠檬酸钾293.5 g、蒸馏水1000 mL，混合均匀。

2.3.2大肠杆菌OP50培养 从-80 ℃冰箱中取出冻存的大肠杆菌OP50菌液，于LB固体培养基上用接种环划线，37 ℃培养过夜，取单克隆菌落接种到LB液体培养基中，置于摇床上，37 ℃，培养10～12 h，备用，可根据要求稀释处理。

2.3.3线虫培养 在已制备好的NGM培养皿上用涂棒每板涂400 μL的大肠杆菌OP50菌液，37 ℃培养过夜，冷却后将冻存在-80 ℃冰箱内的秀丽隐杆线虫MT2124取出，迅速解冻，铺于培养基上，在21 ℃培养箱中培养至成虫。

2.3.4线虫同步化 将在培养皿中培养了5～6 d的线虫用M9缓冲液冲洗到5 mL离心管中，静置，弃去上清后，剩下液体少许，加入裂解液，在涡旋仪上震荡约7 min，使线虫充分裂解，3000 r·min-1(离心半径9 cm)，离心3 min后，弃去上清液，用M9缓冲液冲洗2次，弃去冲洗液，得到线虫虫卵。加M9缓冲液至1 mL，在培养箱中放置48 h后，线虫发育达到Ll期。收集Ll期幼虫备用。

2.3.5药液制备 精密称定三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位及残余部位粉末各0.5 g，用DMSO配制成质量浓度为250 mg·mL-1的药液，超声辅助溶解，精密吸取200 μL，以蒸馏水稀释并超声，得到质量浓度为25 mg·mL-1的混悬状母液，然后按一定浓度梯度稀释备用。

2.3.6分组与给药 在96孔板上精密加入M9缓冲液80 μL、线虫液20 μL及按一定浓度梯度稀释的药液100 μL，使其终质量浓度为0、0.156 25、0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1，混合均匀，并设置相应空白对照和阴性对照组，空白对照组为不加药液线虫组，阴性对照组为溶媒对照组(包含M9缓冲液80 μL、线虫液20 μL及DMSO 100 μL)，以检测DMSO是否对线虫有影响。

2.3.7鸦胆子不同部位急性毒性测定 加药后24 h，显微镜下观察线虫死亡情况，采用浮游生物计数板计数，并根据公式(1)计算线虫死亡率。

死亡率=加药后线虫数量/加药前线虫数量×100%

(1)

各萃取部位对线虫的半数致死量(LC50)结果见图2。三氯甲烷部位毒性较大，标准曲线方程为Y=10.195 04+20.304 74X，拟合度R2为0.951 73，r为 0.975 6，经计算其LC50为1.96 mg·mL-1；乙酸乙酯部位与残余部位毒性在一定范围内随质量浓度增大而增大，但并未达到半数致死，故各部位的急性毒性大小为三氯甲烷部位>乙酸乙酯部位>残余部位。

图2 鸦胆子不同萃取部位对秀丽隐杆线虫的急性毒性

2.4 鸦胆子各部位抗肿瘤作用

2.4.1大肠杆菌及线虫的培养 按照2.3.1项下条件培养大肠杆菌OP50，按照2.3.2项下条件大量培养线虫。

2.4.2药液制备 将2.3.4项下制备的质量浓度为25 mg·mL-1的药液经0.45 μm微孔滤膜滤过，按一定浓度梯度稀释备用。

2.4.3分组与给药 根据预试验结果，在96孔板上加入S基础液140 μL、线虫液20 μL、大肠杆菌OP50菌液20 μL及一定浓度梯度的药液20 μL，最终三氯甲烷部位的质量浓度为2、10、50 μg·mL-1，乙酸乙酯部位的质量浓度为20、100、500 μg·mL-1，残余部位质量浓度为20、100、500 μg·mL-1，混合均匀，并设置相应空白对照和阴性对照。

2.4.4不同部位抗肿瘤作用 以野生型秀丽隐杆线虫为药物抗肿瘤作用评价指标，考察不同浓度、不同部位药液抗肿瘤作用，按照公式(2)计算野生型线虫占比。野生型线虫占比越高，则提取物抗肿瘤效果越好。

野生型线虫占比=野生型线虫数/线虫总数×100%

(2)

结果见图3。与对照组比较，随着鸦胆子三氯甲烷部位质量浓度增大，野生型线虫占比显著增大(P<0.01)；乙酸乙酯萃取部位在100～500 μg·mL-1时呈一定抗肿瘤活性；残余部位在500 μg·mL-1时有一定抗肿瘤活性。因此，各部位中，三氯甲烷萃取部位抑制ras突变的抗肿瘤活性最强，乙酸乙取部位次之，残余部位基本无药效。

图3 鸦胆子各萃取部位抗肿瘤活性

2.5 谱效关系研究

三氯甲烷萃取部位抗肿瘤活性最强，其所有色谱峰所对应化学成分均有进一步研究的价值。为了明确其他萃取部位色谱峰与抗肿瘤作用之间的相关性，对乙酸乙酯部位与残余部位色谱峰进行偏最小二乘回归(PLS)法分析，并与三氯甲烷部位相结合探讨鸦胆子提取物抑制ras突变肿瘤活性的谱效关系。

以乙酸乙酯部位与残余部位HPLC特征图谱各峰面积作为自变量，野生型线虫占比作为因变量，将峰面积归一化数据导入SIMCA-P 13.0软件中进行分析，计算得到16个色谱峰与野生型虫体比例的标准化回归系数和变量重要性投影(VIP)值(见图4～5)。当VIP>1时，说明所对应化合物对抑制ras突变的肿瘤活性有重要作用。由图5可知，峰7、8、10～12的VIP均大于1。

图4 乙酸乙酯部位与残余部位各色谱峰PLS标准化回归系数

图5 乙酸乙酯部位与残余部位各色谱峰对药效的VIP贡献

3 讨论

人类生长因子受体介导的Ras/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是与细胞增殖、分化、凋亡等密切相关的重要信号通路，该信号通路发生异常与肿瘤的发生、发展密切相关[8]。秀丽隐杆线虫let-60编码的ras蛋白与人类的ras蛋白在前面164个氨基酸中相似度高达83%[9]。秀丽隐杆线虫中的Ras/MAPK信号通路是高度保守的，若let-60过度激活会使线虫阴门数量增多，形成多阴门表型(Muv)线虫，相反则会产生无阴门的线虫汀[10]。秀丽隐杆线虫可作为筛选靶向Ras/MAPK信号通路的药物候选物的模型。本研究采用该模型筛选鸦胆子中抑制ras突变肿瘤活性的萃取部位以及不同提取物的毒性，野生型虫体比例越高，则说明药物抑制ras基因突变作用越强，药效越好。

鸦胆子中的多种化学成分对多种肿瘤具有广泛的抗癌作用。如鸦胆子油乳有明显的抑制肿瘤作用，目前已被应用于临床[11]，可用于肺癌、直肠癌、骨转移癌、宫颈癌等的治疗[12-14]。然而，在提取鸦胆子油过程中，鸦胆子脱脂后产生的药渣却作为畜禽饲料添加剂，导致大量活性成分被浪费[15]。本研究对鸦胆子脱脂后的不同萃取部位进行抗肿瘤活性研究，发现三氯甲烷部位抗肿瘤活性最强，其中14号峰(鸦胆子苦醇)为三氯甲烷部位的特有成分。现代研究发现，鸦胆子苦醇可通过诱发肿瘤细胞的内质网应激(ERS)及抑制人乳腺癌MCF-7细胞的核因子E2相关因子2(Nrf2)来诱导癌细胞凋亡[16]；也可抑制人恶性黑色素瘤A375细胞Nrf2信号通路，激活线粒体凋亡途径相关蛋白，加速癌细胞凋亡，从而抑制癌细胞增殖[17]；还可通过调节细胞内转移相关蛋白的表达而对非小细胞肺癌的转移能力有明显的抑制作用[18]。

本研究结合数学模型与计算机技术分析了鸦胆子三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、残余部位的HPLC图谱与药效学指标之间的内在相关性，能够为筛选鸦胆子不同提取部位抑制ras突变肿瘤的活性成分提供有益参考。其中三氯甲烷萃取部位抗肿瘤活性最强，其所有色谱峰所对应化学成分均有进一步研究的价值。此外，除14号峰(鸦胆子苦醇)外，峰7、8、10～12所对应的化合物对抑制ras突变的肿瘤活性也具有重要作用，目前本研究组正在基于LC-MS技术对这些化合物进行定性定量分析。