四环素类和磺胺类双重抗生素抗性菌的特性

金明兰， 王悦宏， 郝新瑞， 李华南， 姚峻程， 胡 晶，孙赫阳， 张 明， 徐莹莹， 孙世梅， 金宁一

(1.吉林建筑大松辽流域水环境教育部重点实验室， 长春 130118； 2.吉林建筑大学事故预防研究院， 长春 130118；3.山东大学化学与化工学院， 济南 250100； 4.军事医学科学院军事医学兽医研究所， 长春 130022)

近年来，由于制药业和水产养殖业滥用抗生素现象日趋增多，大多数抗生素以代谢产物的形式和未变化的形态进入土壤和水环境，诱发和传播各种抗生素抗性菌，导致土著菌株携带多种抗性基因而发生变性，造成水环境、土壤污染，危害生态系统中的生物存活[1]。磺胺类药物价廉、广谱，广泛用于预防和治疗各种疾病，使得细菌的敏感性减弱，导致抗生素抗性菌株和抗性基因残留污染环境，威胁人类健康，已在水环境、土壤中检测出sul1、sul2、sul3、int1和int2[2-3]。四环素类药物是应用最早的一类化学治疗药物，并且在许多国家广泛使用。虽然城市污水处理厂采取了多种方法和措施去除抗生素，仍然检测出较高浓度的四环素类抗生素[4]。席劲瑛等[5]在污水处理厂分离出的21株四环素抗性菌均属于肠杆菌科，大多属于条件致病菌，且有18 株携带质粒，表现出对其他5种抗生素具有抗性。

不同环境介质中抗性菌或抗性基因(ARGs)不仅在菌群间迁移、转化，而且在动物机体内传播，导致机体产生耐药性，严重污染生态环境，其危害超过抗生素残留本身[6]。随着分子生物学技术的广泛应用，许多学者开展ARGs生态风险评估的研究[7]。刘莉莉[8]等在污水处理厂检测到多种具有抗生素抗性的抗性菌。因此，开展抗生素残留、抗生素抗性菌和ARGs 检测，对于污水处理技术的提高、人类生命安全的都显得十分重要。

基于大观霉素(STP)中抗生素、抗性菌及ARGs 残留较高的原因，现以北方城市STP 为研究对象，检测了STP 中磺胺类和四环素类抗生素的含量；分离、鉴定磺胺类和四环素类抗性菌株，检测9 种常用抗生素的耐药性，四种四环素类ARGs和四种磺胺类ARGs的污染水平，进一步揭示双重抗生素抗性菌污染的潜在危害，以期为高效抗生素处理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试剂

四环素、金霉素、土霉素、青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、阿奇霉素和利福平抗生素(中国药品监督管理局)。DNA 提取试剂盒(TIANGEN Company，美国)； DNA回收试剂盒，感受态细胞(Escherichiacoli DH5α)，质粒提取试剂盒(上海生工)。

1.2 样品采集

2017年7—12月期间，从北方某城市采用A2/O工艺污水处理厂间隔3周采集污泥，共计8次，每次取3个平行样。所有取样器具均经灭菌处理后采集2 kg污泥，加入抑菌剂后冷藏保存，在采样后4 h内完成抗性菌分离工作。

1.3 抗生素含量检测

应用萃取仪进行水样中抗生素的提取、净化后做HPLC-MS检测。具体操作详见文献[9]。

1.4 抗生素抗性菌的分离与耐药性检测

制备两种普通营养琼脂培养皿，一种未加任何抗生素，另一种添加16 mg/mL的四环素。添加四环素的培养液稀释10倍后取100 μL，另取未添加抗生素的培养液100 μL，分别涂布在抗生素抗性平板上，置于37 ℃培养箱中培养1～2 d后，挑取单个菌落，在含有四环素类抗生素的营养琼脂培养皿上划线分离培养，重复3次。

应用上述方法，制备两种普通营养琼脂培养皿，进行磺胺类抗性菌和双重抗性菌的分离[10]。

将分离的抗性菌培养后，按照临床实验室标准化协会的规则，通过微量肉汤稀释法测定抗生素最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，进行四环素抗性菌株的抗生素敏感性检测，确定药物敏感性的临界点[11]。所有检测均设3 次平行重复。

1.5 抗生素抗性菌的耐药性检测

采用微量液体稀释法进行四环素抗生素耐药性检测[12]。 在含有四环素营养培养基中，将所分离培养的菌株接种培养至对数生长期，所获得的新鲜菌液分别接种于含浓度梯度为2～210mg/L的氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、头孢氨苄、四环素、环丙沙星、阿奇霉素、庆大霉素和利福平的营养培养基中，在37 ℃生物培养箱内培养12～24 h后测定光密度(optical density, OD)。

应用上述方法进行磺胺类抗性菌和双重抗性菌的耐药性的检测[13]。

1.6 抗性菌的抗性基因检测

选取四环素类抗生素抗性基因tetW、tetQ、tetM和tetX作为目的基因，引物设计参考文献[14]，进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法检测四环素抗性基因。按照DNA检测试剂盒说明书的方法提取DNA后检测含量及纯度。

应用上述方法进行磺胺类抗性菌和双重抗性菌抗性基因的检测。

选取双重抗性菌分别进行磺胺类抗生素抗性基因sul1、sul2、int1、int2和四环素tetA、tetQ、tetM、tetX基因的检测。

1.7 数据分析

采用SPSS15.0 软件分析数据，P<0.05 为有显著意义，P<0.01 为有极显著意义。

2 结果与分析

2.1 抗生素检测

本研究中，对城市污水处理厂采集的污泥进行四环素、磺胺甲恶唑的检测，检测结果波动性较小，有较好的一致性。污水中四环素的残留量略高于磺胺甲恶唑；冬季的抗生素残留量高于夏季。四环素的残留量最高为203～371 mg/mL,最低为57～101 mg/mL；磺胺甲恶唑的残留量为 38～74 mg/mL。四环素是应用广泛的抗生素，推测为此种抗生素使用剂量较少的原因所致[15]。结果如图1所示。

图1 四环素和磺胺甲恶唑抗生素浓度检测结果Fig.1 Detection results of tetracycline and sulfamethoxazole antibiotic concentration

2.2 抗性菌的分离结果

由表1可见，检测污泥的总细菌数为1.57×108～2.36×108CFU/mL，四环素抗性细菌数为2.78×106～7.45×106CFU/mL，抗性菌所占比例为1.5%～3.6%；磺胺甲恶唑抗性细菌数为2.59×106～5.91×106CFU/mL，抗性菌所占比例为1.4%～2.8%；双重抗性细菌数为5.04×105～2.51×106CFU/mL，抗性菌所占比例为0.3%～1.1%；推测污泥中菌群受四环素类抗生素影响较大[16]。

2.3 抗性菌的耐药性检测结果

本研究中，四环素抗性菌株对利福平的耐受性最弱，呈现双极性，对氯霉素具有最强的耐受性。同样，磺胺类抗性菌株对抗生素的抗性作用相同。多重抗性菌株也对氯霉素具有最强的耐受性，对利福平的耐受性最弱，结果见图2。抗性菌株具有多重抗生素抗性，可能残留的多种抗生素未完全被代谢和分解，在持续性抗生素驱动下可诱发抗性基因突变，在微生物体内中传播抗性所致[17]。国外学者分离125 株携带大环内酯类抗性基因ermB的葡萄球菌中有117 株携带四环素抗性基因tetM[18]，表明抗性菌株含有多重抗性。

图2 抗性菌株对9 种抗生素的最小抑制浓度分布Fig.2 Minimum inhibitory concentration distribution of resistant strains with nine kind of antibiotics

表1 四环素和磺胺类抗性菌数量及所占总活菌数目的比例Table 1 Number of tetracyclines and sulfonamides resistant bacteria and their proportion in total viable bacteria

2.4 抗性菌的抗性基因检测结果

应用聚合酶链式反应(PCR)方法检测四环素类抗性基因tetA、tetM、tetQ、tetX和磺胺类抗性基因sul1、sul2、int1、int2，结果如图3所示。四环素抗性外排泵抗性基因tetQ 和tetA 具有最高丰度，并且酶修饰抗性基因tetX和tetM较低。在四种抗性基因中，tetA属于外部泵蛋白的机制，tetM属于核糖体保护蛋白机制，tetX属于灭活或灭活四环素酶的机制。tetQ编码具有最高丰度的核糖体保护性蛋白质基因，这表明四环素抗性基因残基与抗性机制无关。张衍等[19]研究认为四环素类不同抗性基因之间的丰度差别很大，tetM的比例含量最低，而tetQ为优势基因，丰度、表达均值最高。 在采集的所有样品中，两种编码核糖体保护蛋白基因tetM较低，表明抗性基因存在较大的传播风险。通过检测目的基因的绝对拷贝数相对于基因16S rRNA的绝对拷贝数的含量，表达微生物群落中抗性基因的含量。冬季和夏季样本中抗性基因水平增加，表明抗性基因不仅受抗生素浓度的影响，还与阳光、温度、pH、紫外线与重金属等因素有关，其相关性需要后期大量的研究进行证明[20]。

3 结论

通过以上实验研究，得到以下结论。

(1)四环素和磺胺嘧啶量多、使用时间久，残留较高。

(2)污水处理厂污泥中携带磺胺类抗性基因的四环素抗生菌株数量高于携带四环素抗性基因的磺胺嘧啶抗性菌株。

(3)四环素抗性基因tetX、磺胺类抗性基因sul1检出率较高。