CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物疾病模型构建的应用

冷烨

（北京王府学校 102209）

基因编辑技术是当下研究基因功能的最主要方法，也是后基因组时代的研究内容与热门话题[1]。 这种技术产生于20 世纪80 年代，使用自然状态下同源重组对基因进行定点的敲除或替换[2]。 但由于基因编辑技术成本比较高，消耗的时间很长，极大影响了基因编辑技术的发展[3]。 直到现在，大多数研究也是使用同源重组来实现基因打靶。 不过随着科技水平不断发展，涌现出3 种不同的基因编辑技术，分别是锌指核酸酶技术，CRISPR/Cas9 技术及转录激活因子样效应物核酸酶技术。 3者互相比较，CRISPR/Cas9 系统可以在大部分细胞和个体种进行基因编辑，并且可以精准打靶及修饰[4]。 其实验周期比较短，更加利于观察。 本文主要综述了CRISPR/Cas9 系统的适应性机制和它在基因编辑领域的作用及在疾病模型构建方面的贡献。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术简介

1987 年日本Nakata 研究组在大肠杆菌中发现的特殊DNA序列。 2002 年Jansen 等把带有回文结构的序列称之为CRISPR序列[5]。 由于现代科学对基因编辑技术的要求不断提高，CRISPR/Cas9 基因编辑技术便应运而生。 与传统电子数据交换方法相比，CRISPR/Cas9 系统操作更加简单，效率更高。 这种系统有3 大类型，其中I 型和Ⅲ型需要多种蛋白才能形成切割链，但 II 型只需一种。 相比之下，II 型的性能更好。 所以 II 型CRISPR/Cas 的基因打靶系统运用得更加广泛，并且这种系统内部所包含的Cas9 具有核酸内切酶的活性及crRNA 和tracrRNA。另外，这种系统是通过同向重复的序列和间隔组成。 其中重复序列长度为21～48bp，间隔的序列长度和细菌种类与CRISPR的具体位置有关，一般的长度为26～72bp。 其引导产生的cr-RNA 与tracrRNA 会进行合并，同时也会引导RNA。 这种设计最大优化了Cas9 蛋白对于特定DNA 体外定点的切割，通过CRISPR/Cas9 系统导入的基因编辑，其中sgRNA 会对基因组中的靶向序列进行匹配，所产生用来剪切基因组的酶会在基因组中产生一个双链切口。 细胞内部也存在非同源末端连接和源重组这2 种修复方法，因此，目标基因组可以进行任意的组合排序。 在确立CRISPR/Cas9 系统后，人们便开始将其用于医疗研究及动物研究，尤其表现在医疗中的建立疾病模型等方面。 目前看来，这种基因编辑技术已经足够成熟，运用于各个领域。

CRISPR/Cas9 不仅可以作为基因编辑工具，还可以通过创建目标实现有效的基因组编辑，当然，也有其他方面的作用。它除了在基因编辑领域有贡献外，在内源基因表达和调控上也发挥极大作用。 几乎每一个生物体的细胞都有相同的DNA 序列，所以，使用这种系统进行编辑非常高效。 但细胞分化会产生不同的有机体。 这个成就主要是因为染色质的获取。 表面看来，基因组记录了DNA 和蛋白的化学变化基因组重编程和表观基因组编辑，是基因组编辑的一个分支，目的是在不改变基因组序列的情况下对染色质标记和基因表达进行针对性的改变。 为了编辑具有高度空间和时间特异性的表观基因组，基因组编辑技术其实是一种新的方法，它可以实现持久的基因调控，在基础研究和分子医学中有很大的发展空间。 此外，CRISPR/Cas9 系统可以用于染色体位点的活细胞标记，这对于染色体的可视化起到很大帮助。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术在动物疾病模型构建的应用

CRISPR 基因编辑技术在疾病模型建立上有很大作用。2014 年研究人员第一次通过尾静脉注射CRISPR 系统进入到成年小鼠肝脏，破坏了p53 和PTEN 两个重要的抑癌基因，由此构建了小鼠肝脏肿瘤模型。 该模型与传统的基因打靶方法构建的肿瘤模型有很像的外形，但相比之下CRISPR 成本更低，速度更快。 另外，在尾静脉注射带有规定靶点的CRISPR 系统的同时，也注射了同源臂模板序列，由此实现小鼠肝脏组织中非常重要的癌基因点突变，更加体现出这种系统编辑的准确性。所以，科学技术开始致力于CRISPR 系统的研究并已实现大脑和肺部基因组编辑，由此构建更多的疾病模型。 同时我们也了解到，使用小鼠癌变疾病模型可以更加直观准确的观察表型和病毒机制。 也有学者同样利用慢病毒介导CRISPR/Cas9 系统对小鼠造血干细胞的基因位点进行编辑，由此又构建出小鼠急性骨髓白血病细胞模型。 部分学者发现这个技术可以用于人类，于是就将CRISPR/Cas9 技术运用于人肠道癌变器官上的研究，然后进行一系列实验与观察，并且发现其中有5 种不同的癌变器官模型。 此研究表明通过激活其通路突变可以在肿瘤微环境下维持肿瘤干细胞的特性与生长。

一直以来，我科学家的实验对象主要是小鼠，但小鼠寿命太短，生理功能及各方面与人类还存在较大差异，即使是与人类具有同样的遗传缺陷，小鼠也无法完整的模拟人类疾病特征。 同时，小鼠模型不能对疾病情况进行长期追踪，极大限制了研究进度，于是科学家就开始选用猪作为科研实验对象。 因为猪不仅自身有重要的农业生产价值，其繁殖性能也很好，器官大小和生理代谢过程及解剖结构与人类很接近，尤其是心血管系统和神经系统。 使它在生物医药方面具重要用途。 2014 年Hai 把Cas9mRNA 和sgRNA 注入受精卵的卵胞质，经过实验获得了vWF 基因敲除猪，制备了血管性血友病基因编辑猪模型。2015 年Zhou 和Wang 等通过CRISPR/Cas9 技术研究成功获得了酪氨酸酶基因敲除猪、PARK2/PINK1 双基因敲除猪和及PARKIN/DJ-1/PINK1 三基因敲除猪，由此构建了白化病和帕金森病的动物疾病模型。 2016 年kang 等利用CRISPR/Cas9 技术获得了RUNX3 和IL2RG 敲除猪，通过RUNX3 敲除猪的研究完美构建了人类胃癌模型。 另外，IL2GR 敲除猪是一种免疫缺陷猪，这种猪的诞生为再生医学和异种移植的研究有不可或缺的作用。

3 结语与展望

众所周知，CRISPR/Cas9 系统确实在生物基因编辑构建和定点修饰上起重要作用，科研专家把这种技术运用于疾病模型构建及研究遗传变异等方面，同时也体现出这一技术的巨大潜力。 2013 年这种系统的出现，基因编辑就成为热门话题。 也正是由于这种技术的兴起，使我们的科研队伍能更加简单运用并取得突破性成果。 CRISPR 系统能实现精准的基因定点打靶及多重基因编辑。 虽然这项技术为科研提供了许多方便，但其中也存在有一些不足。 如基因治疗方面还不够完善，需要进一步优化开发利用。 就目前来说，这种系统已能实现由2～3 个基因位点编辑基因，但如果让其定位更多的基因位点会不会造成脱靶效应还需要进行深入研究。 尽管如此，CRISPR/Cas9 系统仍然是一种前景无量的基因编辑技术。 这种系统相比其他方式更加划算，在实际运用中更能凸显其优势。 当下，科研专家正着手研究CRISPR/Cas9 系统在人类疾病模型的构建。