FGF21表达系统中的研究进展

王萌，魏健，王云鹏

（1.长春师范大学，吉林 长春 130032；2.吉林省农业科学研究院，吉林 长春 130033）

成纤维细胞生长因子21能够刺激脂肪细胞的葡萄糖吸收，降低血浆中葡萄糖和甘油三醋的浓度，从而纠正多种代谢异常。并且FGF21是FGF家族中发现的唯一没有促有丝分裂活性的基因，因此大大降低了其临床用药的风险，被认为是一种潜在的治疗代谢性疾病的新药。尤其是FGF21与胰岛素相比，FGF21具有过量不导致低血糖的优点。另外FGF21不具备FGF家族经典的促有丝分裂活性，彻底消除了人们对于FGF21致瘤性的担忧，使得FGF21体内用药治疗糖尿病成为可能。FGF21不仅能通过调节糖脂代谢有效抑制糖尿病的发展，针对于多种糖尿病并发症也表现出了明显的抑制作用。由于FGF21作为一种药用蛋白的获得途径十分有限，且价格昂贵，因此而限制了FGF21的临床研究。

1 FGF21的原核表达系统

大肠杆菌被广泛地应用到重组蛋白的生产有生产成本低、操作技术简单等优点，是表达非糖基化重组蛋白的首选，目前FDA批准生产的重组蛋白药物大约有30%由大肠杆菌表达[1]。然而，大肠杆菌胞内表达重组蛋白，具有易被蛋白酶降解、不能形成正确的二硫键和错误折叠等风险，而导致重组蛋白不表达、表达量低以及错误折叠形成包涵体等问题[2]。相对于大肠杆菌细胞质细胞周质是一个氧化环境，有利于二硫键的正确形成促进蛋白质的正确折叠；此外细胞周质蛋白酶含量低，重组蛋白不易被降解；同时细胞周质蛋白总量低，便于重组蛋白的提取纯化，简化了提纯工艺并节约了生产成本[3]。Sec分泌途径是大肠杆菌经典的依赖于N 端信号肽的转运途径，已有许多重组蛋白通过Sec分泌途径成功表达。利用大肠杆菌细胞质周质已经制备出纯度在95%以上且具有生物活性的FGF21蛋白。

2 FGF21的毕赤酵母表达系统

与哺乳动物细胞相比，首先毕赤酵母培养条件简单，适合高密度培养，提高目的蛋白的产量；其次利用甲醇诱导的醇氧化酶Ⅰ启动子，严格控制外源基因的表达，无论是胞内、胞外均可实现外源基因的高表达。DNA转化率高，拥有真核蛋白修饰系统，如糖基化、二硫键的形成及蛋白酶解加工，并且毕赤酵母自身分泌蛋白水平较低，表达的外源蛋白易于分离纯化[4]，尤其适用表达外源蛋白。邵明龙等[5]利用毕赤酵母中表达FGF21，获得蛋白纯度达90%。但在已完成的表达过程中存在表达量较低，且蛋白稳定性差，易降解，无法获得具有完整结构的FGF21等问题

3 FGF21的油体表达系统

植物油体表达系统具有完整的真核表达系统，经糖基化、酰基化、磷酸化等翻译后加工过程，可使其表达产物具有与高等动物细胞一致的生物活性。同时，植物油体表达系统表达的外源蛋白利用油体亲脂疏水的特性，使转基因植物种子经过“粉碎－液体抽提－离心”处理，将融合蛋白从转基因植物种子中分离出来[6]大大简化了目标蛋白与受体内源蛋白的分离和纯化工艺，降低了纯化成本。目前，已有成功利用油体表达系统生产目标蛋白的先例。

油体表达系统是基于降低某些植物表达蛋白的提取、纯化成本而研制的一种新的植物表达体系，其具有以下特点：首先油体基因的表达受激素和发育的调控，使油体基因只在种子成熟过程中表达，因此通过外源基因与油体基因进行融合，可以使目的基因在植物的种子中特异表达；其次油体基因的转录在开花后4～6周，成熟种子中的mRNA急剧降低，因此油体蛋白可在成熟种子中稳定存在。目前利用油体表达系统已经成功地表达了人胰岛素[7]、木聚糖酶等蛋白。本研究的蛋白检测结果可以进一步证明利用油体表达系统表达外源基因的可行性。目前，FGF21在微生物中的表达量虽然较高，但一般呈包涵体形式表达，纯化及复性成本较高，而且活性不高[8]。FGF21在油菜油体中的表达，增强了其稳定性，这将为药用蛋白FGF21研究奠定基础。

付宏岐等人初步建立了以PMI为安全筛选标记的拟南芥遗传转化体系，成功获得了表达FGF21蛋白的转基因拟南芥株系[9]，并收获了T1代拟南芥种子；PCR扩增和Southern blot检测结果证实，重组FGF21基因以单拷贝和多拷贝2种方式插入到转基因拟南芥基因组中；BandScand 5.0软件和West-ern blot分析检测结果显示，FGF21融合蛋白约占转基因拟南芥种子可溶性蛋白的3.76%，并具有良好的免疫原性。

植物生物反应器与其他生物反应器如动物反应器、蛋白的原核表达等相比有许多明显的优势，如低成本、安全、操作简单、蛋白能正确折叠及得到真核相关修饰等，已被广泛研究并应用在药物蛋白的生产上。目前，已有成功利用番茄稳定表达系统生产目标蛋白的先例，如张丽华等[10]利用樱桃番茄成功遗传转化了胸腺肽基因。近些年来，随着基因工程等生物技术的不断发展，以转基因技术为代表的植物基因工程技术，为农业的可持续发展提供了强有力的支持，已有几十种药用蛋白或多肽在植物中成功表达[11]。

李海燕等人将FGF21基因转入番茄中[14]，以番茄为生物反应器生产FGF21蛋白，旨在为进一步提高番茄的利用价值及为利用其他植物生物反应器表达FGF21蛋白提供理论参考。