那屈肝素钙联合rhAPC对脓毒症患儿TLR3和sE-选择素的影响

2020-12-15刘红伟安冀坤刘艳静

国际检验医学杂志 2020年23期

刘红伟,安冀坤,陈丽,刘燕,刘艳静

(华北石油管理局总医院：1.儿科；2.皮肤科；3.营养科；4.护理部，河北沧州 062552)

脓毒症的发生、发展与免疫功能紊乱、异常炎性反应及凝血功能障碍密切关联，可引起心、肺、肾等器官衰竭甚至脓毒性休克，最终危及生命[1-2]。特别是儿童患者，由于脓毒症早期缺乏特异性病症，易延误治疗，因此在常规抗感染、液体复苏治疗基础上进行抗凝血治疗以改善患儿凝血和免疫功能至关重要[3]。肝素钙作为常用的抗凝血药物，可有效改善脓毒症患儿凝血功能，但是对于患儿的抗炎作用疗效并不明确。重组人活化蛋白C(rhAPC)是一种丝氨酸蛋白酶，可通过调控丝氨酸蛋白激酶活化通路、胞外调节蛋白激酶水平等抑制血栓素形成，发挥抗炎作用[4-5]。Toll样受体3(TLR3)是病原体感染机体后宿主单个核细胞通过免疫结合产生的TLR，其可识别患儿体内病原体，从而通过调控下游信号通路启动炎性反应，调控基因表达及激活氧化应激反应；而可溶性E选择素(sE-选择素)可介导中性粒细胞黏附于内皮细胞，导致患儿血管内皮细胞损伤从而调控炎性反应，二者水平均可作为脓毒症进展的评价指标[6-7]。因此，本文将以凝血功能及TLR3、sE-选择素等为评价指标，进一步探讨那屈肝素钙联合rhAPC治疗儿童脓毒症的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料本研究对象为2016年6月至2019年12月于本院收治的200例脓毒症儿童，根据随机数字表法分为对照组和观察组A、B、C，每组各50例，年龄3～15岁。4组患儿性别、年龄、小儿危重病例评分(PCIS)等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。纳入标准：(1)符合Sepsis3.0中的关于脓毒症的诊断标准[8]；(2)中华医学会儿科学分会制定的PCIS均超过65分。排除标准：(1)存在严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍者，有血液、免疫、神经系统疾病者；(2)发病前接受免疫抑制剂治疗者；(3)对低分子肝素、rhAPC过敏，依从性、耐受性差。患儿入组前均由家属签署知情同意书，且该研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2治疗方法对照组患儿采用常规抗感染治疗，并在治疗期间适时地补充营养以纠正水电解质紊乱和维持患儿体内酸碱平衡，具体给药方式如下：静脉滴注平衡液(晶体/胶体=2/1)，剂量为20～30 mL/kg，速度为99 mL/h。维持患儿中心静脉压在8～12 mm Hg，若患儿收缩压偏低(≤90 mm Hg)，则可添加去甲肾上腺素或者多巴胺，直到收缩压不低于90 mm Hg，若患儿清除率(Cl)低于41.7 mL/min，则可添加巴酚丁胺。观察组A患儿在对照组的基础上静脉注射rhAPC(厂家：美国Biotic公司；批号：jt-w0738)，2 500 U溶于生理盐水(每毫升注射液中含有25 mg人血清清蛋白，5 mg 甘氨酸，5.9 mg枸橼酸钠)，连续静脉注射给药96 h，24 μg/ (kg·h)。观察组B患儿在对照组基础上皮下注射那屈肝素钙(厂家：Sanofi Winthrop Industrie；规格：0.4 mL，4 100 AXaIU；国药准字J20040118)，每次0.4 mL，12 h 1次，7 d为1个疗程。观察组C在对照组的基础上联合使用那屈肝素钙、rhAPC，给药方式分别同观察组A、B。3组患儿均持续治疗1个疗程，在整个治疗过程中医护人员需密切关注患儿的血压、体温、心率等临床体征。

表1 4组患儿一般资料比较

1.3观测指标

1.3.1临床疗效治疗7 d后评估临床疗效。(1)体温稳定在36～38 ℃；(2)心率恢复至正常水平；(3)呼吸频率小于20次/分；(4)白细胞计数(4～12)×109/L。上述指标至少符合3项则被判断为有效[9]，治疗有效率=有效例数/总例数。统计分析患儿住院时间及治疗7 d后的PCIS。

1.3.2血气指标治疗7 d后测量患动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、血氧饱和度(SaO2)水平。

1.3.3T细胞亚群指标、TLR3及sE-选择素水平在治疗前和治疗7 d后早晨抽取患儿空腹外周静脉血约3 mL×3份，其中2份用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂处理得抗凝全血，1份以淋巴细胞分离液处理，获取外周血单核细胞(PBMC)，应用流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)计数外周血T细胞亚群指标(CD3+、CD4+、CD8+)水平，并计算其占淋巴细胞的百分数；另1份使用单个核细胞分离液得到单个核细胞，经固定、破膜及上样处理后应用流式细胞仪测定TLR3表达水平，荧光染色的TLR3阳性细胞所占总体细胞的百分比即为TLR3的表达阳性率。第3份于4 000 r/min离心10 min(半径10 cm)，上清液置入EP管中并保存于-70 ℃待检。应用酶联免疫吸附试验检测EP管中血清sE-选择素水平，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3.4凝血功能指标分别在治疗前及治疗7 d后采用凝血分析仪(厂家：德国BE股份有限公司；型号：Thrombolyzer XRM型)测定患儿血小板计数(PLT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fib)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、D-二聚体(D-D)水平。

1.3.5不良反应观察并记录患儿治疗过程中用药反应。

2 结果

2.1临床疗效比较治疗后观察组C的有效率高于其他3组(P<0.05)，观察组A、B有效率接近，对照组最低；观察组C病死率最低，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2血气指标比较与治疗前相比，治疗7 d后4组患儿PaO2、SaO2水平增加，而PaCO2水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中观察组C治疗效果最好，血气指标优于其他3组(P<0.05)，观察组A、B疗效相近，但优于对照组(P<0.05)。见表3。

2.3自然杀伤细胞(NK细胞)百分率比较与治疗前相比，治疗后4组患儿外周血NK细胞亚群各水平均有所改善，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中CD3+、CD4+水平增加，CD8+水平降低，其中观察组C改善效果最佳(P<0.05)。见表4。

表2 4组患儿临床疗效对比[ n(%)]

2.4凝血功能指标比较与治疗前比较，治疗7 d后4组患儿的 PT、PLT、 APTT、TT、 Fib、D-D水平均有改善，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中PLT、Fib水平增加，而PT、APTT、TT、D-D水平降低，且观察组C改善最佳(P<0.05)。见表5。

2.5TLR3、sE-选择素水平比较与治疗前比较，治疗7 d后4组患儿的TLR3、sE-选择素水平均降低(P<0.05)，其中观察组A、B、C治疗7 d后各水平低于对照组，以观察组C降低程度最大(P<0.05)。见表6。

2.6PCIS比较治疗7 d后，4组患儿的PCIS均高于治疗前(P<0.05)，观察组A、B、C的PCIS高于对照组(P<0.05)，观察组C的PCIS高于观察组A、B (P<0.05)。见表7。

2.7住院时间比较治疗7 d后，观察组A、B、C住院时间短于对照组，观察组C住院时间短于观察组A、B (P<0.05)。见表8。

2.8不良反应比较 4组患儿治疗期间不良反应主要为颜面潮红、皮疹、血性膀胱炎，不良反应均较轻，且对症治疗后均很快消失，4组患儿不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表9。

表3 4组患儿治疗前后血气指标比较

表4 4组患儿外周血NK细胞水平比较

表5 4组患儿凝血功能指标比较

组别nFib(g/L)治疗前治疗7 d后TT(s)治疗前治疗7 d后D-D(mg/L)治疗前治疗7 d后观察组A501.54±0.462.42±0.38abc28.56±4.7617.37±2.501abc1.85 ± 0.410.76± 0.22abc观察组B501.49±0.512.35±0.43abc27.48±4.4118.76±3.02abc1.81 ± 0.370.98± 0.28abc观察组C501.42±0.472.72±0.45ac27.83±4.6114.30±2.75ac1.78± 0.341.02± 0.26ac对照组501.46±0.432.05±0.50c26.79±4.3520.24±3.12c1.89 ± 0.311.16± 0.24c

表6 4组患儿TLR3、sE-选择素水平比较

表7 4组患儿PCIS比较分)

表8 4组患儿住院时间比较

表9 4组患儿不良反应比较

3 讨论

脓毒症是一种由细菌、病毒等病原体感染而致的全身性炎症反应综合征，病原菌入侵后刺激机体产生大量促炎症介质，进而刺激机体产生大量炎症因子，导致免疫异常，凝血系统紊乱，最终引起多系统、器官病理学改变，是引起重症监护病房患儿死亡的重要原因[10]。目前脓毒症的常规治疗在于改善临床病症(发热、营养失调、电解质紊乱等)，并配合抗感染、抗血栓治疗等。由于脓毒症是多种促凝血因子、炎症介质引起的全身性的炎性反应，常规治疗方案疗效有限，因此在常规治疗基础上采用强效炎性因子抑制剂可有效改善炎性反应对机体的侵袭，从而调控凝血功能，降低炎性反应对重要脏器的损伤，进而有利于预后。rhAPC作为一种人工合成的蛋白C类似物，其可通过活化内皮细胞蛋白C受体、血栓调节蛋白从而激活磷酸鞘氨醇、PAR-1，发挥抗炎、抗凝血等功效[11]。本研究结果显示，在常规治疗基础上配合肝素的抗凝治疗，以及rhAPC的抗炎治疗，能迅速改善患儿临床症状，有效改善患儿血气指标及PCIS，提高治疗有效率，降低病死率，缩短住院时间。整个治疗过程中尽管4组患儿均存在一定程度的不良反应(颜面潮红、皮疹、血性膀胱炎等)，但对症治疗或者停药后均很快消失，且4组患儿的不良反应发生率无显著性差异，表明联合治疗安全性可靠，值得临床推广应用。

有研究显示，脓毒症患儿往往存在免疫系统、凝血系统紊乱，其中免疫系统中CD4+、CD8+等NK细胞表达紊乱，导致机体异常炎性反应，使得血管内皮细胞受损，诱导促凝血因子的高表达，使各凝血指标异常，如，D-D是交联Fib特异性的降解产物，其水平与病情严重程度呈正相关； PLT参与止血和堵塞伤口，其水平升高则会导致生物化学性的黏附聚合，各个物质相互配合，最终诱导血凝状态的发生[2,12-13]。因此在抗凝治疗基础上联合使用rhAPC进行抗炎治疗，可通过改善炎性反应和凝血功能，从而减少内皮损伤，共同改善患儿临床症状。本研究结果显示，治疗后4组患儿外周血NK细胞亚群水平及凝血功能指标较治疗前均有所改善，但均以观察组C改善效果为优，表明在常规治疗基础上配合使用肝素和rhAPC可有效改善患儿凝血功能和免疫功能，这与沈萍[11]报道一致。

脓毒症患儿在发生异常炎性反应时，机体会释放大量的炎症介质，同时改变机体免疫应答，如激活免疫细胞死亡程序，其中TLR作为机体病原相关分子识别受体，在患儿受到病原菌侵袭时可触发免疫应答反应，调节患儿免疫功能， TLR3是TLR中可唯一识别病毒双链RNA的受体，其水平变化可有效反映病原体感染机体后的免疫应答情况[14]。 TLR3作为免疫应答反应的上游阶段，sE-选择素则是作为免疫调控结果的中下游阶段，其可介导中性粒细胞黏附于内皮细胞，引起内皮细胞损伤，从而使得炎性反应加重，高表达于脓毒症患儿血清中，因此可作为脓毒症患儿治疗效果的评价指标[15]。本研究结果显示，治疗后4组患儿的TLR3、sE-选择素水平均降低，观察组A、B、C低于对照组，而观察组C降低程度最大(P<0.05)，表明在常规治疗基础上配合使用肝素和rhAPC可有效降低TLR3和血清sE-选择素水平，从而调控机体免疫功能和改善机体炎症异常情况，最终有利于患儿预后。分析认为，常规治疗可一定程度杀死病原菌，从而降低TLR3受体的表达，进而阻断下游免疫级联放大效应，调控NK细胞的表达水平，即CD3+、CD4+水平增加，CD8+水平降低。联合使用那曲肝素钙时，抑制Ⅶa、Ⅸa等凝血因子活性，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、组织因子途径抑制物增多，导致血小板聚集，降低黏附聚集、改善血流动力学状态、减少内皮细胞损伤等，故而治疗后患儿PLT、Fib水平增加，而PT、APTT、TT、D-D水平降低，凝血功能得到改善[5]，而rhAPC则可通过凝血酶-血栓调节蛋白激活蛋白酶激活受体(PAR)-1通路，以及上调1-磷酸鞘氨醇，进一步降低机体炎性反应[11]，使sE-选择素表达水平降低，减轻内皮细胞损伤，故而形成循环调控体系，调控凝血功能，改善免疫功能和炎性反应，提高治疗效果。