福白菊胎菊与朵菊粗多糖体外抗氧化活性分析

王蔚新,张 俊,占剑峰,吴 鹏,胡 婷,沈峻峰

(湖北省经济林木种质改良重点实验室，大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，黄冈师范学院生物与农业资源学院，湖北 黄冈 438000)

麻城福白菊为菊科多年生草本植物，以麻城市福田河镇为主产区，故称为麻城福白菊，简称福白菊，属国家地理标志产品，湖北重要的道地药材[1]。产区常年菊花种植面积2 700 hm2产量4 600 t，是全国最大的菊花生产基地，与浙江桐乡、江苏盐城并称中国药用保健白菊花三大产地。麻城福白菊具有“朵大肥厚、花瓣玉白、花蕊深黄，汤液清澈、金黄带绿，气清香，味甘醇美”等品质特征，具有散风清热、明目解毒之功效。

研究表明，菊花主要化学成分有多糖类、黄酮类及挥发油类等，其中多糖类具有抗氧化、抗衰老、降低血糖、调节脂代谢和抗辐射等功能，并能增强机体免疫力和抗病能力等生物活性功能[2-4]。与杭白菊、贡菊等知名品种相比，福白菊的知名度略逊一筹，相关理化及生物活性研究也较少。本研究采用水提醇沉法提取福白菊胎菊与朵菊粗多糖，并通过测定其总抗氧化能力及三种自由基清除能力研究其体外抗氧化活性，旨在筛选一种天然食品抗氧化剂，同时为福白菊的进一步开发和利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

福白菊朵菊和胎菊购自湖北麻城，干燥后粉碎，过50目筛，于干燥、避光环境中密封冷藏。

葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、无水磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、抗坏血酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、浓盐酸、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水等均为国产分析纯。

1.2 实验设备

紫外可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司；H/T18MM型台式高速离心机,湖南赫西仪器装备有限公司；SHZ-III型循环水真空泵,上海亚荣生化仪器厂；RE-5205型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂；FA2004型电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LGJ-12型真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 福白菊粗多糖的提取

参照陈云[5]的方法，并略有改动。准确称取福白菊朵菊和胎菊粉末各10 g，以料液比1∶25 (g/mL)加入蒸馏水，提取温度为90 ℃，提取时间为2 h，提取液5000 r/min离心10 min，收集上清液，沉淀重复提取两次，合并上清液并过滤。将滤液于60 ℃条件下进行旋转蒸发，浓缩后的体积为原来体积的1/4～1/3，向浓缩后的提取液中加入95%的乙醇溶液，摇匀，4 ℃醇沉12 h，4000 r/min离心5 min，弃上清液，收集絮状沉淀，冷冻干燥至恒重，得到粗多糖，并按公式计算提取率。

粗多糖提取率%=粗多糖质量/原料质量×100%

1.4 粗多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[6]测定菊花粗多糖中多糖的含量。

1.5 粗多糖抗氧化测定

1.5.1总抗氧化能力

采用Fe3+还原能力测定的方法[7]。配置不同浓度的样液(抗坏血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，分别取1 mL于试管中，加入2.5 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲液，摇匀后加入2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，充分混匀后于50 ℃反应20 min。再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，并加入5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液，反应30 min后，于700 nm处测吸光值(A)。以蒸馏水作为参比液测其吸光值(A0)。每个样品试验3次，取3次试验的平均值。

总抗氧化能力:△A=A-A0

式中：A-添加样品的吸光值，A0-空白对照液吸光值。

1.5.2DPPH自由基清除能力

参照冯燕茹等人[8]的方法，并略有改动。配置不同浓度的样液(抗坏血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，分别取4 mL于试管中，加入4 mL 0.15 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，混匀后避光静置30 min，于517 nm处测其吸光值(Ax)；以无水乙醇作为参比液测其吸光值(A0)；取样品与等体积无水乙醇混合(不加入其它试剂)，测其吸光值(Ax0)。每个样品试验3次，取3次试验的平均值。

DPPH自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

式中：Ax-添加样品的吸光值，Ax0-样品与无水乙醇等体积混合液吸光值，A0-空白对照液吸光值。

1.5.3羟基自由基清除能力

采用水杨酸法[9-10]，并略有改动。配置不同浓度的样液(抗坏血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，分别取2 mL于试管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，室温下静置10 min后，再加入6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，摇匀，室温下静置30 min后，于510 nm处测其吸光值(Ax)；以蒸馏水作为参比液测其吸光值(A0)；重复上述试验，将水杨酸溶液换成蒸馏水测其吸光值(Ax0)。每个样品试验3次，取3次试验的平均值。

羟基自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

式中：Ax-添加样品和水杨酸的吸光值，Ax0-添加样品和蒸馏水的吸光值，A0-空白对照液吸光值。

1.5.4超氧阴离子自由基清除能力

参照王丽霞等人[11]的方法，并略有改动。配置不同浓度的样液(抗坏血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，加入5.7 mL 6mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)于试管中， 37 ℃条件下保温20 min，然后依次加入不同浓度样品溶液各2 mL，再加入0.1 mL 6mmol/L的邻苯三酚溶液，摇匀，于37 ℃反应6 min，最后加入1 mL 0.1 mol/L的HCl溶液终止反应，于320 nm处测其吸光值(Ax)；以蒸馏水作为参比液测其吸光值(A0)；重复上述试验，将邻苯三酚溶液换成蒸馏水测其吸光值(Ax0)。每个样品试验3次，取3次试验的平均值。

超氧阴离子自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

式中：Ax-添加样品和邻苯三酚的吸光值,Ax0-添加样品和蒸馏水的吸光值,A0-空白对照液吸光值。

2 结果与分析

2.1 菊花粗多糖的提取率与含量比较分析

冷冻干燥得到福白菊朵菊和胎菊粗多糖提取物，经计算提取率分别为11.12%、10.47%。陈云[5]采用水提醇沉法提取杭白菊多糖，提取率达到11.74%，与本研究结果相近。

苯酚-硫酸法测定多糖含量。以葡萄糖标准品浓度为横坐标(X，g/L)，在490 nm处吸光度值A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，如图1。回归方程为y=10.257x+0.0019，R2=0.9979。

图1 葡萄糖标准曲线Fig. 1 Standard curve of glucose

结果表明，福白菊朵菊和胎菊粗多糖中的多糖含量分别为64.01%、55.32%(以葡萄糖计)。同样利用水提醇沉法，杨春[12]等提取野菊、杭菊粗多糖，含量分别为19.03%、49.52%；马力等[13]从金菊花中提取多糖成分，并用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，结果表明提取的多糖含量为86.59%；陆颖[14]利用热水、酶辅助、稀碱水提取的野菊花粗多糖，含量分别为16.43%、30.19%和30.19%。由此可见，各种菊花粗多糖的含量因菊花品种、采收阶段及提取工艺不同而存在较大差异。

2.2 福白菊粗多糖体外抗氧化分析

2.2.1总抗氧化能力表现比较

总抗氧化能力是测定抗氧化性的重要指标之一，通过测定体系中Fe3+-Fe2+的转化程度来确定多糖总抗氧化能力的强弱。由图2可见，在0.1～0.7 g/L之间，随着浓度的增加，福白菊胎菊与朵菊粗多糖总抗氧化能力均呈上升趋势，且朵菊粗多糖总抗氧化能力略大于胎菊(P<0.01)，两者存在极显著差异。同时，以VC的总抗氧化能力强弱作为对照，胎菊和朵菊粗多糖的总抗氧化能力均低于同等浓度的VC。当质量浓度为0.7 g/L时，朵菊和胎菊粗多糖的总抗氧化能力分别为0.427和0.395，为同等浓度VC的17.4%和16.1%。表明福白菊朵菊与胎菊具有一定的总抗氧化能力。刘宇琪等[15]采用水提醇沉法提取同源灵芝子实体和孢子粉中的多糖，经过分离纯化，得到4种多糖并进行体外抗氧化研究，结果表明，在质量浓度为1.0 g/L时，这4种多糖总抗氧化能力依次为0.283、0.728、0.291和0.471，均低于VC。

图2 VC、胎菊与朵菊粗多糖总抗氧化能力比较Fig. 2 Total antioxidant capacity of VC and crude polysaccharide from chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

2.2.2DPPH自由基

DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在517 nm处有强吸收。当溶液中存在自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对，其在517 nm处吸收会减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性[16]。由图3可见，在0.1～0.4 g/L之间时，随着质量浓度增大，福白菊胎菊与朵菊粗多糖DPPH自由基清除率呈上升趋势；当质量浓度超过0.4 g/L时，福白菊胎菊与朵菊粗多糖DPPH自由基清除率趋于平缓。在0.1～0.7g/L浓度范围内，朵菊的清除能力均略大于胎菊(P<0.01)，两者存在极显著差异。以VC的DPPH自由基清除能力的强弱作为对照，在同等浓度下，胎菊和朵菊粗多糖的DPPH自由基清除能力低于VC。当浓度达到0.7 g/L时，朵菊和胎菊粗多糖的DPPH自由基清除率即可达到93.39%、91.50%，相当于同等浓度下VC的97.73%、95.75%，因此具有较强的DPPH自由基清除能力。郑昌平[17]以怀菊花为原料，经提取、分离纯化，得到9种均一多糖组分，并进行DPPH自由基清除实验，研究发现，各个多糖样品都表现出一定的DPPH自由基的清除能力，清除能力随着浓度增加而增加，当浓度为1.0 g/L时，CMJA0S2多糖组分的清除能力最强，达到81%，具有明显的抗氧化保护作用。

图3 VC、胎菊与朵菊粗多糖DPPH自由基清除能力比较Fig. 3 DPPH· scavenging ability of VC and crude polysaccharide from chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

2.2.3羟基自由基

羟基自由基是一种毒性较强的活性氧自由基，对生物机体具有很强的破坏作用，主要氧化损伤细胞中的生物大分子[18]。由图4可知，当福白菊胎菊与朵菊粗多糖浓度在0.1～0.7 g/L时，清除率呈上升趋势，当浓度大于0.3 g/L时，朵菊的清除能力大于胎菊(P<0.01)，两者存在极显著差异。当浓度为0.7 g/L时，福白菊朵菊与胎菊粗多糖对羟基自由基清除率为51.12%、46.55%，相当于同等浓度下VC的65.08%、59.26%。因此，福白菊胎菊和朵菊粗多糖对羟自由基均具有一定的清除作用。杜萍等[19]利用落叶松锈迷孔菌产胞外多糖进行抗氧化研究，结果表明，随着多糖浓度的增加，清除羟自由基的能力不断增强，当浓度为2.0 g/L时，落叶松锈迷孔菌胞外多糖对羟自由基的清除率可达到77.64%，高于1.4 g/L浓度下VC对羟自由基的清除率(77.21%)，具有较强的羟自由基清除能力。

图4 VC、胎菊与朵菊粗多糖羟基自由基清除能力比较Fig. 4 ·OH scavenging ability of VC and crude polysaccharide from chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

2.2.4超氧阴离子自由基

超氧阴离子在体内较容易产生，而抗氧化剂能清除超氧阴离子，使邻苯三酚的氧化产物在波长320 nm处的吸收峰受到抑制，通过检测中间产物的生成量，可测定抗氧化剂对超氧阴离子的清除能力[20]。由图5可知，随着质量浓度的增加，福白菊胎菊与朵菊粗多糖溶液对超氧阴离子自由基清除率不断增大，且朵菊的超氧阴离子自由基清除能力略大于胎菊 (P<0.01)，两者存在极显著差异。当质量浓度0.7 g/L时，朵菊和胎菊粗多糖溶液对超氧阴离子自由基清除率分别达到39.06%、34.55%，相当于同等浓度的条件下VC的64.96%、57.46%。因此，福白菊胎菊和朵菊粗多糖对超氧阴离子自由基均具有一定的清除作用。熊磊等[21]从滁菊醇提药渣中用纤维素酶法提取多糖，研究滁菊多糖抗氧化性，结果表明，滁菊多糖浓度范围在0.2～1.0 g/L 时，对超氧阴离子自由基的清除率为8.66%～48.26%，滁菊多糖的浓度为1.0 g/L的超氧阴离子自由基清除率超过0.2 g/L的VC。

图5 VC、胎菊与朵菊粗多糖超氧阴离子自由基清除能力比较Fig. 5 scavenging ability of VC and crude polysaccharidefrom chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

本研究以水提醇沉法获得福白菊胎菊和朵菊的粗多糖，并对不同浓度粗多糖进行抗氧化性能测定。研究结果发现，福白菊胎菊与朵菊粗多糖均具有较强的总抗氧化能力，以及清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基、羟基自由基能力，且其总抗氧化能力、自由基清除能力与其浓度均呈量效关系，表明其具有良好的体外抗氧化作用。虽然福白菊胎菊与朵菊粗多糖体外抗氧化活性弱于VC，但在一定浓度范围内仍能体现出良好的抗氧化性质，这对天然抗氧化剂的筛选具有一定的研究和应用价值。