离子色谱两种检测器测定乳制品中亚硝酸盐和硝酸盐方法比较

文/梁 晨 郑秀瑾 金晓晓 张锦梅 张苗苗

（青岛盛瀚色谱技术有限公司）

亚硝酸盐和硝酸盐广泛存在于自然界中，亚硝酸盐可与食物中的仲胺、叔胺和酰胺等胺类反应结合成强致癌物亚硝胺，同时人体内有一类细菌叫硝酸还原菌，它可使硝酸盐还原成亚硝酸盐，因此硝酸盐往往表现亚硝酸盐的毒性[1～3]。乳制品中的亚硝酸与硝酸盐的含量往往是痕量的，但是新生婴儿对两种污染物特别敏感，食用亚硝酸盐或含有硝酸盐浓度高的食品可能导致高铁血红蛋白症，表现为紫绀，甚至死亡。因此，国家标准对婴儿配方奶粉中这类物质的含量有严格的规定，其中亚硝酸盐的含量不得超过100.0 mg/kg，硝酸盐的含量应小于2.0 mg/kg[4～6]。婴幼儿配方奶粉含有婴幼儿发育过程中所必需的一切营养成分，是婴幼儿生长发育过程中的理想食品。一些婴幼儿配方奶粉在生产过程中，经过了特殊的处理调制，使其蛋白质组分更接近于母乳，但在这个过程中会加入大豆蛋白质，从而带进来亚硝酸盐的成分[7]。因此，检测奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐含量十分必要。

目前检测亚硝酸盐和硝酸盐的方法有镉柱还原-分光光度法[8，9]、分子荧光法[10]、光电检测法[11]、气相色谱法[12，13]、离子色谱-紫外线法[14]（IC-UV）、离子色谱-电导法[15]（IC-CD）等。其中镉柱还原-分光光度法中，硝酸盐采用镉柱还原成亚硝酸盐，再采用对氨基苯磺酸和盐酸萘乙二胺法测定或磺胺和N-1-1萘基-乙二胺二盐酸盐法测定亚硝酸盐，由此得到亚硝酸盐的总含量，再用亚硝酸盐的总含量减去亚硝酸盐的含量，即可得到样品中的硝酸盐含量。该方法需分步测定硝酸盐和亚硝酸盐，操作繁琐，重现性差，且在试验过程中检验人员需要接触具有致癌性的镉，对实验室操作人员有潜在的危害，此外，分光光度法易受溶解的有机物及一些金属离子的严重干扰。近些年来虽有报道在线透析和在线镉柱还原-流动注射光度法测定乳制品中的硝酸盐和亚硝酸盐的方法[16]，但是仍有废弃重金属镉产生，镉对环境容易造成污染，处理较复杂。分子荧光法虽然较灵敏，但是样品中干扰物的存在会增加或降低荧光强度导致相对标准误差增大[17]。光电检测法是将显色的试纸条在光电检测仪的感应窗里检测，具有简便、快速等特点，但重现性不好，定量结果不精确。气相色谱法是先将样品分离蛋白质后，加入试剂将其制成硝酸盐-2-S-丁酚化合物的五氟化苯甲酰酯的形式，或利用硫酸催化样品中的硝酸离子与苯发生反应生成硝基苯，最后用电子捕获检测器进行检测，该方法虽然可以实现同时检测，但操作较复杂。IC-UV和IC-CD前处理相对简单，分析快速，无有害物质产生，重现性好，可同时进行多组分测试[18]。本文对比两种检测方法，旨在建立适合于同时快速测定乳制品中硝酸盐和亚硝酸盐且能普遍适用的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

CIC-D160型离子色谱仪，青岛盛瀚色谱公司，配SHRF-10型氢氧化钾淋洗液发生器、SHD-6恒温电导池、色谱柱恒温系统、SHY-6型阴离子连续自动再生微膜抑制器、HW-2000型色谱工作站；U C-3 2 9 2 紫外检测器；UPT-Ⅱ-20L型超纯水机；Mettler Tole-do AL-104型电子天平；TG18-WS型离心机；KQ 2200型超声波萃取仪；超滤杯；一次性有机系针式滤膜。

固相萃取柱：SPE IC-C18（1 mL）、SPE IC-Ag（1 mL）、SPE IC-Na（1 mL）青岛盛瀚色谱公司。固相萃取柱使用前需要进行活化，其活化过程为：C18小柱使用前依次用5 mL的甲醇及10 mL的超纯水过柱，活化，然后放置10 min使之充分平衡；Ag柱和Na柱用10 mL水过柱，静置活化10 min使之充分平衡。

1.2 样品与试剂

冰乙酸（分析纯）、乙腈（分析纯），美国 Sigma-Aldrich 公司；试验用水为超纯水（电阻率小于18.25 MΩ·cm；NO2-、NO3-标准储备溶液：1 000 mg/L（国防科技工业应用化学一级计量站）；样品为市售奶粉样品。

1.3 离子色谱条件

S H-A C-1 1 阴离子色谱柱（250 mm×4.6 mm），SHAG-1（4 mm×50 mm）；淋洗液为淋洗液发生器产生的高纯氢氧化钾溶液，浓度为8 mmol/L，流量1.0 mL/min，进样量100 μL，柱温和检测器均为35 ℃；SHY-6型抑制器的抑制电流为50 mA，系统压力4.7 Mpa；紫外检测器波长214 nm。

1.4 样品处理

准确称取1 g奶粉于10 mL容量瓶中，先加适量超纯水，再加3.00%乙酸1 mL，超声30 min后，定容，静置。取上述上清液用超纯水稀释10倍，8 000 r/min离心10 min。取上清液依次过活化后的C18固相萃取柱，Ag柱，Na柱，弃去前9 mL流出液，收集后面的洗脱液待测。再过0.45 μm的针式过滤头后，上机分析。

2 结果与分析

2.1 离子色谱中淋洗液的选择及优化

SH-AC-11阴离子色谱柱采用CIC-D160内置淋洗液发生器，由纯水在线产生的高纯度氢氧化钾作为淋洗液，操作简便，尤其是对复杂样品检测更有优势。奶粉样品中的氯离子含量较高，因此，试验设置了淋洗液浓度5 mmol/L、8 mmol/L、13 mmol/L、15 mmol/L，考察这4 个条件下亚硝酸盐、硝酸盐与杂峰离子的分离效果。当淋洗液浓度低于8 mmol/L时，样品中待测离子与其他杂峰分离效果分离较好，但分析测定时间过长；当淋洗液浓度高于8 mmol/L时，分析测定时间缩短，但实际样品中含有大量氯离子，与亚硝酸盐分离效果不佳。综上所述，淋洗液浓度选用8 mmol/L。取亚硝酸盐与硝酸盐的混合标准溶液，其中亚硝酸盐质量浓度为1.00 mg/L，硝酸盐为2.00 mg/L，在色谱条件下进行测试，亚硝酸盐与硝酸盐的标准色谱图见图1。

2.2 检测波长的选择

通过紫外可见分光光度计及查阅资料对亚硝酸盐与硝酸盐标准溶液扫描分析，在214 nm处测定时，不但干扰小，亚硝酸盐和硝酸盐的灵敏度也最高。因此，试验选择214 nm作为紫外检测器波长。

2.3 超声提取时间优化

图1 电导检测器和紫外检测器下标准品谱图

图2 超声提取时间对样品提取效率的影响

为了能够充分提取样品中的亚硝酸盐和硝酸盐，选用超声方式提取，分别选择超声10 min、15 min、20 min、30 min和40 min，试验结果见图2。如图所示，在10～20 min内，样品测定值随超声时间的延长而逐渐增大；20 min后，亚硝酸盐测定值趋于稳定。而对于硝酸盐，25 min后趋于稳定，虽然40 min处略有增大，但是从总体趋势看，两者提取效率变化不大。因此，为了加快前处理速度，节约时间，设定超声时间为25 min。

2.4 样品沉淀疏水化合物试剂选择

乳制品中含有大量的蛋白质、脂肪、有机酸和无机盐等物质，简单溶剂提取无法将这些干扰物质完全去除。因此，需要能沉淀疏水化合物的试剂。常用的试剂有亚铁氰化钾和乙酸锌、乙腈、乙酸等。用亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂会带入金属离子，损坏离子色谱柱；对比乙腈和乙酸试剂，见图3，由图3 可知，乙腈在后续的固相萃取小柱净化样品过程中，易将杂质物质洗脱下来，干扰亚硝酸盐出峰。用乙酸作为沉淀蛋白试剂，无论是电导法还是紫外法，待测离子与杂质的分离度较好。结果表明，在提取液中加入3.00%乙酸既能够沉淀蛋白质等有机物，不损坏色谱柱，也不会将杂质洗脱下来。

2.5 前处理小柱的优化

样品经过蛋白质沉淀后，还含有残留蛋白质、脂肪等疏水性大分子，会影响分离结果，污染色谱柱从而缩短色谱柱使用寿命。当采用电导检测器时，样品中含有较高浓度的氯离子，亚硝酸盐在阴离子柱上的保留时间靠近氯离子，而样品中亚硝酸盐浓度较低，高浓度的氯离子可能干扰亚硝酸盐的分离和测定；用紫外检测器检测，高浓度的氯离子会改变低浓度亚硝酸离子的保留时间。可采用A g 柱除氯离子。本试验采用了先离心沉淀后，再选择C18固相萃取柱或超滤杯去除疏水性化合物，结果表明，两种方法均可去除溶液中残留的有机化合物，但过超滤杯后样品肉眼可见浑浊，残留蛋白质等疏水性化合物去除不干净，容易过载。经试验，C18固相萃取柱回收率好，洗脱液无可见杂质，且价格合理。因此，选择C18固相萃取柱和Ag柱串联。

表1 检出限及线性参数

图3 不同检测器下乙酸和乙腈沉淀蛋白效果谱图

图4 IC-CD 样品谱图及加标谱图

2.6 线性方程和检出限

取亚硝酸盐与硝酸盐的标准储备液，逐级用超纯水稀释，从低浓度到高浓度依次进样，按照试验部分的仪器工作条件进行测试，以标准溶液的峰面积和浓度绘制工作曲线。得到IC-CD法和IC-UV法标准曲线。亚硝酸盐和硝酸盐的线性范围、线性回归方程、相关系数和方法检出限（3S/N）见表1。

2.7 IC-CD 和IC-UV 检 测方法对比

选用3.00%的乙酸作为沉淀蛋白质试剂。在优化的前处理及色谱条件下，选用电导检测器和紫外检测器，对奶粉样品进行色谱分析，并进行加标试验，结果见图4和图5。样品检测结果见表2。由表1，2可知，两种方法的加标回收率均能够达到要求，但电导检测器的检出限优于紫外检测器。由图4和图5可知，因前处理过程中加入了乙酸，IC-CD法中乙酸和氯离子会影响到亚硝酸离子出峰，且在基质复杂情况，IC-UV法的杂峰出峰较少。

表2 样品中阴离子的精密度和加标回收率结果（n=6）

图5 IC-UV 样品谱图及加标谱图

3 小结

本试验分别采用I C-C D 和IC-UV测定乳制品中亚硝酸盐和硝酸盐含量。经测试，IC-CD法虽检出限低，但在实际样品测定中，亚硝酸离子易受氯离子和乙酸离子影响。IC-UV法在基质较复杂情况下杂峰响应低或无响应，可避免氯离子对亚硝酸离子干扰，但检出限相对较高，且需要配备紫外检测器。两种方法各有优劣，可根据实际需要自行选择。