补肾安胎颗粒的质量标准研究

熊青，陈胜辉，李恒

江西中医药大学附属生殖医院，南昌 330004

补肾安胎颗粒是江西中医药大学附属生殖医院临床经验方，由党参、槲寄生、炒白芍、枸杞子、续断、杜仲、淫羊藿、白术、熟地黄、仙茅、炙甘草等11味中药饮片加工制成，具有补肾养胎、健脾养血之功效，临床用于肾虚型黄体功能不足引起先兆流产和实施辅助生殖技术后的助孕安胎治疗。补肾安胎颗粒为医院制剂，尚无有效的质控标准，本文采用薄层色谱（TLC）法对补肾安胎颗粒中的枸杞子、川续断、赤芍、淫羊藿和甘草进行定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法对补肾安胎颗粒中的芍药苷进行定量分析，为有效控制补肾安胎颗粒质量提供标准。

1 材料

1.1 仪器

LC-10ATvp岛津高效液相色谱仪，SCL-10ATvp检测器；KQ-400DE型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；万分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；TW20水浴锅（德国Julabo公司）。

1.2 样品与试剂

补肾安胎颗粒（自制，批号：20180401、20180402、20180403）；川续断皂苷Ⅵ（111685-201707）、芍药苷（110736-201741）、淫羊藿苷（110737-201516）、党参炔苷（111732-201607）、甘草苷（111610-201607）齐墩果酸（110709-201808）、毛蕊花糖苷（111530-201713）等对照品，枸杞子（121072-201611）、杜仲（121202-201103）、白术（120925-201611）、熟地黄（121196-201406）等对照药材，均购自中国食品药品检定研究院。硅胶GF254板（青岛海洋化工厂，批号：20070927）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 补肾安胎颗粒的制备

取组方的11味中药饮片，加5倍量水进行煎煮，每次煎煮时间为1 h，共煎煮2次，将煎液合并后给予滤过处理，随后浓缩滤液呈稠膏，稠膏相对密度为1.20～1.25（60 ℃），70 ℃减压干燥，粉碎，加入甜菊素、糊精适量，混匀，制粒，干燥，制成颗粒，即得。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 枸杞子的薄层鉴别供试品溶液：取适量补肾安胎颗粒，研细，称取4 g，加甲醇40 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，加水20 mL使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。

对照药材溶液：取枸杞子对照药材0.5 g，加水35 mL，煎煮至微沸15 min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得对照药材溶液。

缺枸杞子阴性溶液：取适量缺枸杞子阴性样品，同供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

照薄层色谱法试验：吸取供试品溶液5 μL、缺枸杞子阴性溶液5 μL、对照药材溶液5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1）作为展开剂，经展开，取出，置于紫外光灯（365 nm）下检视，对照药材色谱与供试品色谱相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。结果见图1。

2.2.2 续断的薄层鉴别供试品溶液的制备：取适量补肾安胎颗粒，研钵研细，精密称取4 g，加甲醇40 mL超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水约20 mL使溶解，通过已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径为1 cm，柱高为15 cm)，依次以水、30%乙醇、50%乙醇各100 mL洗脱，弃去，再以70%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取川续断皂苷Ⅵ对照品，加入甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即为对照品溶液。

缺续断阴性溶液的制备：取适量缺续断阴性样品，同供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。

照薄层色谱法试验：吸取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL、缺续断阴性溶液10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，选取正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5）上层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图2。

由图可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

2.2.3 炒白芍的薄层鉴别供试品溶液的制备：取补肾安胎颗粒适量，研钵研细，精密称取粉末4 g，加甲醇40 mL超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加20 mL水使溶解，用水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

缺炒白芍阴性溶液的制备：取缺炒白芍阴性样品适量，照供试品溶液的制备方法同法制成缺炒白芍阴性溶液。

照薄层色谱法试验吸取上述供试品溶液、缺炒白芍阴性溶液15 μL、对照品溶液5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图3。

由图可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

2.2.4 淫羊藿苷的薄层鉴别供试品溶液的制备：同枸杞子的薄层鉴别试验中供试品溶液的制备方法。

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

缺淫羊藿阴性溶液的制备：取缺淫羊藿阴性样品适量，照供试品溶液的制备方法同法制成缺淫羊藿阴性溶液。

照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10 μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105 ℃加热数分钟，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图4。

由图可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

2.2.5 炙甘草的薄层鉴别供试品溶液的制备：取补肾安胎颗粒适量，研钵研细，精密称取粉末4 g，加水20 mL使溶解，离心，取上清液，通过D101型大孔吸附树脂柱（柱长12 cm，柱内径约1 cm，湿法装柱，用水50 mL预洗），用水洗至洗脱液近无色，再用60%乙醇30 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，取上清液作为供试品溶液。

甘草苷对照品溶液的制备：另取甘草苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

缺炙甘草阴性溶液的制备：取缺炙甘草阴性样品适量，照供试品溶液的制备方法同法制成缺甘草阴性溶液。

照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热数分，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果见图5。

由图可见，对照品色谱与供试品色谱相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

2.3 HPLC法测定补肾安胎颗粒中芍药苷的含量

2.3.1 溶液的制备对照品溶液的制备：取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的内容物研细，取约1.5 g，精密称定，加稀乙醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，以稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

缺炒白芍阴性溶液的制备：取缺炒白芍阴性样品适量，照“供试品溶液的制备”方法制备，即得。

2.3.2 色谱条件Diamonsil C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（14∶86）；流速：1.0 mL/min；检测波长为：230 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

2.3.3 系统适用性试验分别精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液和缺炒白芍阴性溶液，按“2.3.2”项下色谱条件进样测试。芍药苷保留时间约在9 min，与其它各峰达到基线分离，且阴性无干扰，理论塔板数按芍药苷峰计为3 000以上。色谱图见图6。

2.3.4 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液（芍药苷浓度为24.36 μg/mL）30、20、10、8、5、2 μL，注入液相色谱仪中，记录相应色谱图，横坐标为芍药苷进样量，纵坐标为峰面积，据此绘制标准曲线，得回归方程：Y=125 383.360X-5 498.209 0，R2=0.999 9。结果表明，芍药苷在0.048 96～0.730 80 μg范围内具有良好的线性关系。

2.3.5 精密度与重复性试验取芍药苷对照品溶液，连续进样6次，RSD为1.83 %；取批号20180402的补肾安胎颗粒样品6份，依法测定，RSD为0.93 %，本法精密度和重复性良好。

2.3.6 稳定性试验取对照品溶液、供试品溶液，按样品测定项下的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24 h后依法测定，RSD分别为1.69%和1.24%，结果表明，对照品溶液和供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验取已知含量的补肾安胎颗粒6份，精密称定，分别精密加入芍药苷对照品溶液1 mL（每mL含芍药苷0.675 6 mg），参照供试品溶液制备方法制备加样回收样品溶液，并依法进行测定，计算溶液回收率，平均回收率分别为100%、50%、99.96%、98.89%、99.45%、101.08%、100.37%，RSD为0.78%，本法回收率良好。

2.3.8 含量测定和限度取批号20180401、20180402、20180403样品测定芍药苷的含量，芍药苷含量分别为11.6、11.5、11.5 mg/袋（每袋12 g）。

《中国药典》2020年版一部炒白芍项下规定：水分不得过10.0%，含量按干燥品计算，含芍药苷（C23H28O11）不得少于1.2%。本品每1袋中含炒白芍1.668 g，芍药苷的转移率约为45%。考虑到大生产环节中的损耗等因素，以40%转移率计算，本品每袋含芍药苷为7.2 mg。故拟将本制剂含量限度定为：本品每袋含炒白芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于7.2 mg。三批样品的含量均符合规定。

3 讨论

3.1 含量测定指标的选择

本制剂君药为党参、槲寄生。党参药材标准《中国药典》2020年版一部［12］收载，该标准中仅有浸出物的测定，未收载含量测定方法，由于未有适宜的含量测定指标，故暂未建立党参的含量测定方法。槲寄生药材标准《中国药典》2020年版一部收载，该标准中测定紫丁香苷的含量，含量限度为按干燥品计算，含紫丁香苷（C17H24O9）不得少于0.04%。以该限度计算，本制剂中紫丁香苷的含量低于万分之一，不适宜作为本制剂的含量测定指标。白芍具有养血调经的功效，为本制剂的臣药之一，芍药苷为炒白芍中的有效成分，故拟将芍药苷作为本品的含量指标。参照2020年版《中国药典》中白芍项下含量测定方法，采用HPLC法测定本品中芍药苷的含量。

3.2 含量测定波长的选择参考相关研究方法［13-18］，在230 nm波长处芍药苷有较强的吸收，选择230 nm作为测定波长建立了HPLC法测定补肾安胎颗粒中芍药苷的含量测定方法，结果显示峰形对称，分离度良好。

综上所述，本试验建立的TLC法专属性强、斑点清晰，阴性对照无干扰。同时测定补肾安胎颗粒中芍药苷含量的HPLC法，准确性好、灵敏度高，可以作为补肾安胎颗粒的质量控制手段之一。