植物组织培养技术在马铃薯上的应用

代欣玉，孙璐

（沈阳工学院，辽宁抚顺 113122）

植物组织培养技术（简称“组培技术”）以植物细胞的全能性为理论基础，将植物离体的根、茎、叶、花、果实等器官、组织、细胞和原生质体于人工可控的无菌条件下，在营养充分、培养条件适应作物生长的人工合成培养基上，使组织或者器官通过培养，发育成完整植株或者生产出其他高于原有价值的产品。植物组织培养也被称为“离体培养”或“试管培养”。目前，组培技术在多种作物上应用，如为优化城市内园艺植物的绿化面积，常采用植物组织培养技术以无性繁殖手段，提升兰花、迎春花等绿化植物的生长效率，改善城市内的绿化状况；草莓的易感病毒种类颇多，为优化草莓栽培品种，通过组培技术培育草莓脱毒苗，在很大程度上减少病害发生并培育出多种优良品种。物种多样性是自然发展的基础，通过组织培养技术可以实现对濒临灭绝植物的扩繁，从而大量繁殖，保护濒临灭绝的植物[1]。

马铃薯是在粮食、菜、饲料、工业原料等方面都有重要用途的兼用型经济作物，且栽培条件不严格、抗逆性强、营养物质含量高、适应性强，从而成为继水稻、玉米、小麦之后的第四大粮食作物[2]。随着我国农业的发展，多种不同新型栽培技术的推广和应用扩大了马铃薯的生产与销售。其中，组培技术以单倍体育种、离体扩繁、培育脱毒苗等多种措施，提高了马铃薯栽培速率，在传统培育方法的基础上，获得了具有生产速率高、性状优良、无毒的优质马铃薯品种，为马铃薯的生产与销售提供更多可能。本文对现有研究成果进行了总结，以期为马铃薯组织培养研究提供参考。

1 植物组织培养技术在马铃薯上的应用现状

1.1 在马铃薯育种上的应用

植物组织培养通过特有的培养方式，为马铃薯育种提供了更多可能，完成了常规育种不可能实现的目标和任务，比如在育种过程中，缩短育种周期从而加快育种进程，达到传统培育方法难以实现的速度；可同时选择多种具有优良性状的野生品种进行育种，从而克服育种周期性退化问题，培育出同时具有多种优良性状并可稳定遗传的纯系马铃薯品种；实现对马铃薯优质种质资源的筛选和濒危品种的保存，维持马铃薯种质资源的多样性[3]。在马铃薯的育种过程中，用秋水仙素处理经过花粉、花药诱导形成的单倍体植株，使染色体加倍即可得到后代不分离同源二倍体的纯合系，这就可以直接对杂种一代亲本或性状纯合的常规品种进行下一步的选育。依据花粉、花药培育的单倍体育种方法，在马铃薯的育种过程中，可以较常规育种更加快速、准确地得到马铃薯的纯系，这就加速了马铃薯育种的进程，提高了马铃薯的品质，从而有利于马铃薯的生产培育与市场销售。

连年种植马铃薯会引起品种感染病毒从而发生退化，此时的感病马铃薯必须经过茎尖脱毒法去除病毒后再生产。姜超[4]通过在MS 培养基中加入不同浓度配比的生长调节物质以防止彩色马铃薯褐变，经过对比筛选最优配置方案，从而建立了彩色马铃薯茎尖脱毒组培再生体系，为彩色马铃薯新品系幼苗抗旱性鉴定提供脱毒组培苗。

1.2 在马铃薯离体快繁上的应用

植物离体快繁技术（微型繁殖）是植物组织培养手段中效果最好、应用范围最广的一项技术[5]。植物组织离体快繁培养不受地域和季节条件的限制，在人为可控的培养环境中，繁殖速度快，比普通的田间育种方法要快万倍甚至数十万倍，为农作物的选育开辟了新的途径。

马铃薯为无性繁殖，一般情况下是将马铃薯杂合型植株用于田间生产，马铃薯种子繁殖的后代会因为出现不同程度的变异，从而很难维持马铃薯原种的优良性状[6]，繁殖率不高，多代繁殖以后容易出现病虫害，影响马铃薯的品质。相比于常规育种方法，马铃薯离体快繁技术可以有效解决这些在生产栽培中可能产生的不利结果，通过离体快繁培育出健壮、优良、脱毒的种薯，能够保证在短时间内获得品质优良、营养丰富、感官品质优异的马铃薯品种。

1.3 在马铃薯脱毒苗培育上的应用

在马铃薯的连年栽培中，由于马铃薯的无性繁殖方式，导致病虫害的侵染与病毒的长期积累，并通过种薯遗传给子代植株，再经过受害过程中蚜虫等媒介的传播扩大，引起马铃薯的产量和品质下降。因此马铃薯脱毒苗的培育成为解决此问题的关键。目前应用广泛的马铃薯脱毒技术主要包括茎尖分生组织培养、热疗法、电疗法、化学疗法、冷冻疗法等[7]。

1.3.1 茎尖脱毒培养技术

茎尖分生组织脱毒培养技术是应用范围最广的一种脱毒手段。在细胞分裂旺盛的分生组织，由于细胞分裂已经消耗了大量的营养物质，导致在病毒的复制过程中得不到足够的营养物质而受到抑制，难以进行；分生组织中没有维管束系统供植物体内的病毒移动，病毒仅可以依靠胞间连丝缓慢移动，因此，茎尖脱毒培养技术利用植物分生组织不含病毒的原理，将分生组织从植物体内分离出来，进行组培并获得脱毒苗。

茎尖脱毒技术的脱毒率高、速度快，但同时也存在局限性。如对茎尖大小的要求较严格，茎尖越小脱毒效果越好；对材料营养状况要求较高，但因茎尖体积小，内部营养物质及水分含量极低，影响脱毒苗正常的生长发育；对剥离技术要求严格。近年来，马铃薯茎尖脱毒技术的研究重点集中在对不同产区、不同品种的茎尖脱毒培养基配方及茎尖的剥离方式上，且多专注于脱毒茎尖成活率提高上。徐燕等[8]利用茎尖脱毒技术以马铃薯为材料进行了多个对比试验，研究得出该方法是不同激素配比下马铃薯出苗率高、污染率低的最佳培养配方。

1.3.2 热疗法脱毒培养技术

热疗法是在不损伤植物组织的前提下，使植物病毒蛋白质外壳受热变性，通过对病毒向分生组织细胞运动的预防、抑制病毒复制、以及降解病毒RNA 等方式来实现植物脱毒。热疗温度和持续时间是影响热疗法进程的重要因素；热疗法具有方法简单、效果明显的优点，但在去除病毒方面有局限，只对圆形、线状病毒有效，而对杆状病毒无效；植物材料耐热能力差，极易在热疗过程中过热枯死，只有小部分植株可以存活下来；在钝化病毒的同时，植物组织内的抗性因子也有可能因钝化而降低脱毒效果。

热疗法对马铃薯卷叶病毒最敏感，同时对其他马铃薯病毒，如PVX、PVS 等也有不同程度的抑制作用，热疗法常与茎尖分生组织培养同时进行，共同作用，可以显著提升脱毒效果。尹明华等[9]通过采用茎尖培养与热疗法对6 种不同马铃薯病毒交替进行处理，通过对比研究与分析，成功脱除了怀玉山高山马铃薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒。

1.3.3 电疗法脱毒培养技术

电疗法是将植物组织如马铃薯茎尖、茎段、芽等外植体，持续通5～100 mA 电流5～25 min，感染的病毒在电脉冲加热的条件下，核酸变性，失去毒性从而达到脱毒的效果，脱毒后移入培养基中继续培养。电疗法不影响外植体再生，同时还具有高效率、操作简便、快速脱毒等优点。胡国君等[10]指出电疗法在1996 年首次被应用于对马铃薯不同感病类型的全面而系统的脱毒试验。目前，此方法在国外应用较为广泛，国内应用较少，科研工作者已利用此技术成功脱除了PVX、PVY、PLRV、PVA、PSTVd等多种病毒。

1.3.4 冷冻疗法脱毒培养技术

冷冻疗法脱毒培养技术的原理是超低温对细胞的选择破坏性，由于茎尖细胞内的水分含量高，因此在冰冻条件下，含有病毒的茎尖细胞转变为冰晶，随后即被崩解杀死，由此实现对胞质浓度高、可抵抗冰冻环境、病毒含量少的分生组织细胞进行保存，在此基础上结合组培技术培育出马铃薯无毒种苗。相比茎尖脱毒技术，冷冻疗法脱毒培养技术更高效便捷、易操作，因此该方法在多种马铃薯病毒的脱毒培育中效果显著[11]。

与传统脱毒方法相比，冷冻法在脱毒进程中对试验材料的尺寸大小没有要求，具有操作简单、脱毒率高、速度快、成本低等优点，可以用于马铃薯等其他作物的大量生产。但冷冻疗法在目前的应用中还存在着有待攻克的难题，如在低温保存和冷冻脱毒的过程中，经低温处理后的茎尖，其存活率和再生率降低，造成损失。因此，冷冻保护剂的创新是以后冷冻脱毒法研究中的重点。王彪[12]以“紫花白”马铃薯茎尖为材料进行试验，将其置于超低温环境中培养，并与德国马铃薯超低温库应用的DMSO 滴冻法进行比较，得出超低温保存的马铃薯茎尖再生率更高且可有效脱除PLRV 和PVY 病毒。目前，国内外科学家已采用马铃薯冷冻疗法脱毒技术成功高效脱除了PVM、PVX、PVY、PVS、PLRV 等病毒。

2 马铃薯组织培养中常见的污染源及解决措施

2.1 污染源分析

植物组织培养技术是在人工培养基上完成的，虽然是在人工可控的无菌环境中进行的，但出现污染问题也是不可避免的。引起污染的原因有多种，操作过程的任何不严谨环节都有可能导致组织培养材料被污染，整个培养过程失败，这些污染的污染源主要有支原体、病毒、真菌、细菌以及不同种细胞的污染，其中最常见的是真菌和细菌[13]。

导致细菌性污染最主要的原因是，在培养过程中，操作人员使用的接种工具消毒不彻底、在操作过程中的行为不规范、培养材料处理不正确等。细菌性污染导致培养基或马铃薯培养材料的表面产生黏液状杂质或菌落，还有可能出现水渍状混浊或泡沫发酵状，这些污染状况一般在接种的1～2 d 后就可以显现[14]。在由真菌引起的真菌性污染的培养容器内，往往会出现白、黑或绿色的菌丝块，其中以曲霉、毛霉和青霉属真菌最常见，由此可见，霉菌通常是真菌性污染的主要源头。

2.2 污染防治措施

马铃薯组培育种过程中的这些污染问题，可以通过有效措施来避免。首先，要对培养基和马铃薯组培苗进行部分杀菌消毒，从源头抑制污染的出现，培养基封口后立即进行高温高压灭菌，防止菌类大量滋生；其次，在接种过程中须严格遵守操作规范，确保操作技术与流程正确无误，以及对操作工具、设备进行充分彻底的灭菌消毒。为杀菌彻底，操作过程中灭菌锅内应留有空隙，保证蒸汽流通和热交换的正常进行；基础苗在接种之前应仔细筛选，将已经被污染、存在被污染隐患的基础苗及时清除，使用75%酒精擦拭装有基础苗的容器瓶身及盖口，并在超净工作台进行紫外灯照射消毒后备用。最后，在马铃薯组培苗的生长发育过程中，需要调控其生长环境，将各项指标调节至最适合组培苗生长的范围，保证其健壮生长；安装完善的消毒杀菌装置，定期消毒，抑制污染源滋生，使其更有利于马铃薯组培苗的无菌生长。

3 展望

我国作为马铃薯产量最高的国家，目前已经在马铃薯主粮化战役中打响了第一枪。在马铃薯脱毒苗的生产过程中，还有很多问题需要解决[15]。首先是脱毒马铃薯的研制，简单易操作、安全效率高、脱毒速度快的脱毒技术是马铃薯实现主粮化必不可少的一部分。而且马铃薯品种繁多，易感病毒种类也很多，不同种马铃薯受不同类型病毒感染后，其对各种脱毒措施的敏感程度也大不相同，往往需要同时采用两种或两种以上脱毒技术对马铃薯进行脱毒处理，多种技术间取长补短，共同进行病毒防治。脱毒马铃薯的经济效益、种植效益远高于未脱毒马铃薯，现阶段我国对于马铃薯脱毒品种的生产栽培还需进一步的改进与完善，才能获得更高品质的脱毒马铃薯品种[16]。其次，组培过程中的污染问题是制约种苗培育的关键因素，目前对于污染的处理不仅有常规的化学手段，而且还可以利用真空减压灭菌、磁力搅拌、超声波振动、混合消毒液等技术和方法对外植体进行灭菌消毒，且效果明显；在培养基中加入两种或两种以上的抗生素，减少细菌污染源头，抑制细菌的抗药性。同时需要解决许多问题，如组培材料灭菌不彻底、抗生素性能不稳定，抗生素易在酸碱条件、加热条件下分解失活，抗生素成本高，促使研究工作者探索寻找性能稳定、耐酸碱、高温高压下不易分解的抑菌剂，从而解决组培过程中出现的污染问题，便于在以后的研究工作中提高试验成功率与效率，减少不必要的损失，进一步提升作物品质。