果蔬发酵酒中高级醇的研究进展

柳新宇，石韶琦，武宇昊，李宁阳

（山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安 271018）

高级醇是指含有2 个碳原子以上的一类醇的统称，沸点高，不溶于水，但溶于酒精，酒精度低时析出呈油状，俗称“杂醇油”[1]。这类物质是酒类发酵过程中的主要副产物，同时也是酒体主要的呈香物质，能提升酒的协调性和浓郁感，酒中约50%的香气由这类物质提供。高级醇结构复杂，在人体中代谢缓慢，含量过高时会对人体造成一定的毒副作用，使人产生面红耳赤、心跳加速、恶心呕吐、头晕头痛等不良反应，也就是俗称的“上头”，严重时还会产生神经中毒、出现幻觉等严重的身体损害现象[2-3]，因此控制酒中高级醇含量有重要的意义。我国一些酒类生产厂家有较严格的高级醇限量标准，大多按照GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》中的有关规定，以每100 mL 饮料酒中高级醇含量不超过0.15 g（以戊醇计）或0.3 g（以异丁醇和异戊醇计）来评判酒中高级醇含量是否符合标准[4]。加入WTO 前，我国酒类的高级醇限量为2.0 g/L，但进口酒中的高级醇含量均高于此标准，为了使进口酒顺利进入中国市场，我国不得不删除了《蒸馏酒及其配制酒》GB 2757—2012 修订版中关于高级醇限量的部分，但从把身体健康摆在首位的角度考虑，控制酒类产品中高级醇的含量具有一定的意义。

高级醇是酿酒过程中酵母合成细胞蛋白质时产生的副产物[5]，主要由两种途径合成，即生物合成途径和糖代谢合成途径，在酿酒过程中，可以通过改变发酵的工艺条件，来抑制高级醇的生成，本文主要总结了高级醇的形成路径、测定方法、影响高级醇生成的因素及控制方法，为优质酒类的工业化生产提供理论依据。

1 酒中高级醇的形成路径

1.1 氨基酸降解代谢路径

顾国贤[6]阐述了氨基酸降解生成高级醇的途径，即发酵过程中氨基酸通过转氨基作用形成α-酮酸，再经过脱羧、还原生成比原氨基酸少一个碳原子的高级醇[6-7]。特定的氨基酸会形成特定的高级醇，例如缬氨酸生成异丁醇，亮氨酸生成异戊醇，苏氨酸生成异丙醇，异亮氨酸生成活性戊醇等[8]。

1.2 糖代谢合成路径

顾国贤[6]阐述了由糖代谢通过丙酮酸合成高级醇的途径，即糖代谢合成路径。酵母通过糖类物质形成丙酮酸，丙酮酸在乙酰羟酸合酶的作用下为氨基酸降解途径提供骨架，在其合成代谢阶段生成α-酮酸中间体，然后经脱羧、还原生成相应的高级醇[5,9]。

2 高级醇的测定方法

2.1 比色法

2.1.1 分光光度计法

分光光度计法是指在一定波长范围内，利用被测物质的吸光度值对该物质进行定性或定量分析的一种方法。在高级醇含量的测定中，本法是利用高级醇（正丙醇除外）在浓硫酸的作用下脱水生成不饱和烃，进而与对二甲基苯甲醛发生反应生成橙黄色物质，该物质在520 nm波长下有最大吸收峰，且含量与吸收值的比值符合朗伯-比尔定律，故可用此法进行定量分析[10]。甄会英等[11]通过对显色后的高级醇标准溶液和苹果酒样进行可见光区的全波长扫描，发现苹果酒中的高级醇在477 nm 下有最大吸收峰；徐文华等[12]通过试验发现高级醇在495 nm处有最大吸收峰。此方法操作简便，成本低，但是存在显色不稳定、重现性差及线性关系不理想等问题[5]，对高级醇只能定量并不能定性分析，且由于高级醇种类复杂，各醇类显色强度不同，故其结果比用气相色谱测得的结果偏低[13]。每种酒中高级醇种类不同，会导致最大吸收峰不同，故常需要进行全波长扫描确定最佳波长，增加了操作的复杂性。

2.1.2 酶标仪比色法

酶标仪比色法是基于朗伯-比尔定律实现对目标化合物的定量分析的一种检测方法，其工作原理、主要结构与光电比色计几乎相同[14]。袁国亿等[15]采用酶标仪法，测定浊米酒在408、450、500、520 nm 下1 h 内的吸光度值，分析得出其标准曲线R2受检测波长和检测时间的影响；再将其结果与气相色谱所测结果进行比较，发现波长为520 nm，检测时间为15 min 时标准偏差均小于0.001 5，变异系数小于3.1%，故酶标仪比色法重现性好、精密度高。但通过与气相色谱法对比发现，酶标仪比色法结果会受高级醇含量的影响，且无法直接对酒中的高级醇进行单一定量。

2.2 气相色谱法

气相色谱法是一种以气体为流动相的色谱法，分为内标法和外标法，具有选择性高、效能高、检测限低、分析速度快、应用范围广等优点[16]，能对酒中的高级醇进行定性和定量分析，且结果较分光光度计法更准确，但气相色谱操作复杂、前处理较多且机器运行及维修费用均较高，不适合在生产过程中进行快速检测。其中外标法要求标准物与被测组分为同一种物质且浓度接近，并且需要在试验操作过程中严格控制进样量，以提高试验结果的精确度[16]。内标法较外标法更准确，不受进样量误差的影响，但也存在内标物易在样品里混合不均匀或与样品组分发生反应、内标物纯度易受影响等问题。黄建明等[17]采用外标法定量测定黄酒中的高级醇，试验结果的相对标准偏差为0.01%～1.03%；甄会英等[18]在葡萄酒的测定中，试验结果相对标准偏差为0.012 0%～1.070 7%；董永鑫等[19]在石榴葡萄酒的测定中，得出试验结果的相对偏差为2.179 7%～3.212 5%，由此可知气相色谱法精密度好、准确度高。

2.2.1 填充柱气相色谱法

填充柱气相色谱法以惰性气体为载气，根据不同物质在固定相中的停留时间不一致，并具有一定的保留时间，利用保留时间与标准品进行比较来定性，利用峰面积或峰高来定量[5]。李惠民等[20]采用401 微球填充柱对桑葚酒中的醇类物质进行分析，发现出峰时间间隔长且基线分离，对试样分离效果好，但填充柱现在使用较少，多与仪器不适配，使用陈旧仪器，效果不佳且手动积分、计算繁琐。

2.2.2 毛细管柱气相色谱法

毛细管柱气相色谱法渗透性好、柱效高且进样量少，分析时间短。闵春艳[21]采用HP-INNOWax 毛细管气相色谱柱测定鹿血酒中的高级醇，发现其分离良好，并且在一定浓度范围内，线性关系良好，检出限为1.6 μg/mL；彭松等[22]采用毛细管柱TG-WAXMS 测定枣酒中高级醇的含量，发现其标准偏差小于5%，最低检出限为0.002～0.007 mg/mL，且操作简单、分离效果好。

2.2.3 顶空固相微萃取-气相色谱法

固相微萃取法是将待测样品与热力学平衡的蒸汽放置在一个密闭系统中进行，广泛应用于挥发性及半挥发性有机物的分析，该方法无需有机溶剂、操作简单。刘拉平等[23]采用固相微萃取方法分析猕猴桃酒中的香气成分，该方法在缩短样品处理时间的同时保留了大量的待测香气组分，极大地提高了灵敏度与准确性。于洪梅[24]使用固相微萃取的方法测定啤酒中的高级醇，并比较了HP-5MS、TG-WAXMS、TG-35MS 三种色谱柱的分离效果，发现TG-WAXMS 色谱柱分离效果好，灵敏度高。

3 影响高级醇含量的因素及其控制方法

3.1 工艺条件

3.1.1 发酵温度

酵母菌易受温度的影响，在一定温度范围内，酵母菌的生长代谢能力随发酵温度的升高而增强，进而增强了高级醇生成相关转化酶的活力，因此由氨基酸合成路径和糖代谢合成路径所产生的高级醇含量增加。相反若发酵温度过低，酵母的生长代谢能力减弱，发酵周期延长，则会导致发酵不完全，影响最终酒类品质[25]。罗惠波等[25]在试验中发现，高级醇含量在20 ℃以下时较低，在25 ℃以上时显著增加；周扬等[26]在百香果酒酿造中发现20 ℃时高级醇含量最低；朱会霞[27]在葡萄酒酿造时发现，当温度超过22 ℃会加快发酵速度，发酵提前终止，最终生成的酒类酒精度低、高级醇含量高。温度较低时，发酵时间延长且发酵彻底，最终生成的酒类酒精度高、高级醇含量低，最终通过实验得出发酵温度控制在20 ℃较为合适。因此可知，发酵温度对高级醇的生成有着显著影响，适当降低发酵温度有利于抑制高级醇的生成。

3.1.2 初始pH 值

酒液初始pH 值会直接影响酵母菌的活性程度，从而影响了酵母的代谢活动，同时酵母菌的活性决定了酒液的发酵时间长短、发酵程度等，进而影响了酒中高级醇的生成。罗惠波等[25]在试验中发现，高级醇的含量与桑葚汁的初始pH 值成正比。当初始pH 值>4.0 时，高级醇的含量明显增加；pH 值<3.5 时，高级醇的含量明显降低；于涛[28]在苹果酒的酿造中发现，当pH≥3.0 时，高级醇的含量与初始pH 值成正比；当初始pH 值≤3.0 时，高级醇和初始pH 值成反比，在pH 为2.5 时，高级醇的生成量最低，为79.33 mg/L；周扬等[26]在试验中发现，高酸组的百香果酒高级醇含量更低。由此可知，降低酒液初始pH 值，有利于抑制高级醇的生成，究其原因可能是酸度影响果胶酶的活性，从而间接抑制了高级醇的生成[29-31]，因此，适当降低pH 值能有效抑制高级醇的生成，减少酒中高级醇的含量。

3.1.3 起始糖度

酿酒是利用糖和酵母作用产生二氧化碳和酒精，每种果蔬固有糖度不同，故需要调节合适的糖度使发酵顺利且达到目标所需的酒精度。高级醇合成的两条路径属于竞争抑制关系，糖量过多，会抑制氨基酸合成路径，促进了糖代谢路径生成高级醇[28]，从而增加了高级醇的含量，故控制初始糖度对高级醇的生成具有重要意义。于涛[28]在苹果酒的酿造中发现高级醇含量随糖度的增大而增大，当糖度≤16%时，高级醇的生成量较少；杨东升等[31]在香蕉酒的酿造中，发现起始糖度对甲醇含量影响较小，但对异丁醇和异戊醇含量影响显著，高级醇含量在起始糖度为22%时最低。张丽芝[32]在枣酒的酿造中通过比较添加浓缩枣汁、葡萄糖和蔗糖发酵后生成的高级醇含量，发现添加浓缩枣汁的酒液高级醇生成量最低。由此可知，起始糖度对酒中高级醇的含量有着一定的影响，降低外源糖量添加，利用果蔬自身的糖来发酵能有效降低高级醇含量。

3.2 酵母菌种类

果蔬发酵酒均在酵母菌的作用下进行发酵，一般采用纯种发酵或自然发酵的方法。目前我国没有果酒专用酵母，大多果酒的酿造使用的是酿酒酵母，也有部分人对酵母进行筛选，进而获取更合适的酵母种类，通过相关试验，发现酵母种类对酒中高级醇的含量有很大影响。邹波等[33]在枣酒的酿造中通过接种4 种不同的酵母发现，不同酵母发酵的枣酒高级醇含量存在明显差异，其中活性干酵母BO213 高级醇生成量最低；蒋成等[34]在无花果酒的酿造中也获得了同样的结果。因此，不同种类的酵母能改变酒中高级醇的含量，选择合适的酵母能有效减少高级醇的产生。

3.3 酵母接种量

在一定范围内，酵母的接种量与发酵时间、酒精度成正比。增加酵母的接种量可以抑制细胞的增殖从而加快发酵速度，氨基酸代谢活动会随着酵母菌的生长代谢受到抑制而减弱，从而减少了氨基酸合成路径生成的高级醇含量[29]。罗惠波等[25]在试验中发现，高级醇的含量随酵母接种量的增加而增加，高级醇含量在酵母菌接种量为4.0×106cell/mL 时最高，然后随酵母接种量的增加而降低；于涛[28]在苹果酒酿造中发现，高级醇含量在酵母接种量9%时最低，为169.74 mg/L；朱会霞[27]在试验中发现，增加酵母菌接种量可降低高级醇含量，在接种量为3.5×107cfu 时高级醇含量最低，但是继续增大酵母接种量高级醇含量不增反减[27]。由此可知，适当的增加酵母接种量可在一定程度上降低高级醇含量。

3.4 可同化氮素

可同化氮素是酵母在酒精发酵中优先利用的氮源，例如铵盐、尿素、α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽等，添加可同化氮素对酒中高级醇的生成有显著影响[35]。傅红雪[36]在蓝莓酒的酿制中，加入345 mg/L 磷酸氢铵和0.336 mg/L 硫胺素，试验结果表明高级醇含量下降了106.36 mg/L。VIDAL 等[37]发现，在可同化氮素含量低的甘蔗汁中添加一定量的铵态氮会降低高级醇的含量。孙时光等[38]在桑葚酒的酿制中，加入磷酸二氢铵，高级醇含量下降7.64%；加入丙氨酸，高级醇含量下降6.73%；加入精氨酸，高级醇含量下降6.33%。张斌等[39]在荔枝酒的酿制中发现，当加入100 mg/L 谷氨酸时，高级醇含量最低。此外，杨生智等[40]在小曲白酒中添加0.4%碳酸氢铵，高级醇含量下降了19%。由此可知，可同化氮素对酒中高级醇的含量有较大影响，合理控制可同化氮素能有效抑制高级醇的生成，且此类物质能被酵母有效利用，可成为未来工业化生产酒类时的氮源补偿剂。

3.5 其他添加物

在酿酒过程中，除了主要原料，通常还会添加一些其他物质（如酶制剂）一同进行发酵，促进果蔬细胞壁的破碎，增加出汁量。同时也会加入SO2进行抑菌，但是硫含量对高级醇的生成也有一定的影响。孙时光等[38]在桑葚酒的实验中发现，发酵1 d 后加入糖化酶、果胶酶、纤维素酶三种制剂，均能有效抑制桑椹果酒中高级醇的生成，分别使高级醇含量下降了5.95%、6.74%、9.01%。同时他还发现，加入20 mg/L K+会使高级醇含量下降8.66%，加入40 mg/L Ca2+使高级醇含量下降4.42%；朱会霞[27]在实验中发现，高级醇的含量随SO2添加浓度的增加而降低，在添加100 mg/L SO2时高级醇含量最低（176.18 mg/L）。由此可知，外源添加物对酒中高级醇的生成有一定影响。

3.6 催陈处理

催陈技术是指借用外力来加快老熟过程，以调节醇酸酯的比例，因此可以影响高级醇的含量。郑新华[4]通过对半成品青梅酒进行超声、微波、臭氧处理后，发现高级醇含量均有所下降。实验得出半成品青梅酒在45 kHz、360 W 频率下超声30 min 后，高级醇含量降低19.63%；用3.6 mg/L 臭氧作用8 min 后，高级醇含量下降了25.34%；在微波中低档火力处理2 min 后，高级醇含量下降了24.93%。因此，对半成品酒采取一定的物理技术处理进行催陈，亦能有效降低酒中高级醇的含量。

4 展望

综上所述，酒中高级醇的生成主要由氨基酸分解代谢和糖代谢产生，两条合成路径在发酵过程中是同时存在的，降低高级醇含量主要从抑制这两条路径入手。通过控制工艺条件，例如发酵温度、初始pH 值、起始糖度等来降低酒中高级醇含量，亦可以通过选择适宜的菌种及接种量、合适的外源添加物，或采取一定的物理技术进行催陈处理等，均有利于降低酒中高级醇的含量。未来，可以主要把这些方法作为降低酒中高级醇含量的主要研究方向。

果酒酿造在我国有悠久的历史，但是果酒中高级醇的含量一直没有明确的限制，故研究果酒中高级醇的含量对提高果酒品质有重要意义。由于果酒的原材料种类广泛，自身的含糖量及营养物质和需要控制的方面不同，致使果酒在酿造工艺上有所不同。果酒目前没有专用酵母，对于果酒中高级醇的控制方法也尚未明确，形成统一标准，故在未来果蔬发酵酒的生产发展中，需要根据原材料的不同，在保证酒感官良好的情况下根据实际情况选择相应的控制措施，从而制作出高品质、低高级醇含量的优质果蔬发酵酒。