浅谈提升动物实验室血凝与血凝抑制检测准确率的方法

肖 欢

（甘肃省两当县畜牧兽医站太阳分站，甘肃 两当 742400）

当前动物实验室使用较频繁的检测方法为血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI），该试验属于血清诊断范畴，通过病毒体现出的凝集红细胞特性进行试验结果的判定。普遍被应用在已知病毒的血清检测中，也是动物实验室运用广泛的实验方法之一。此试验检测过程体现出特异性佳、操作简便、可集中处理大量样本以及对试验环境要求简单等优点。即便如此，该试验检测方法应用不当时，会对试验结果产生严重影响，导致试验失效。

1 血凝抑制试验的常规应用

1.1 抗体水平的监测

完成疫苗免疫的鸡群，HI抗体效价保持在特定水平，如果利用弱毒活疫苗对鸡群进行免疫后，HI抗体的值能够达到1：16～1：64（4㏒2～6㏒2）；如果利用油剂灭活苗对鸡群进行免疫，HI抗体的值能达到1：256～1：512（8㏒2～9㏒2），顶峰时值能达到1：2048（11㏒2）。HI试验可以被设定为有效的免疫检测手段，可以有效避免免疫失败情况的发生。

1.2 鉴定某些病毒

很多病毒都会对动物的红细胞造成凝聚影响，此特性会被特异性抗血清抑制。换言之，当鸡新城疫的血清与鸡新城疫病毒相遇会发生中和反应，但是不会与禽流感病毒发生中和反应。基于此，血清中和实验可以对已知病毒进行判定，还可以用于判断鸡血清中有无特异性抗体，进一步确定鸡群感染新城疫的情况。

2 提升HA和HI准确率的操作

2.1 缓冲液的操作

2.1.1 缓冲液的种类。在展开血凝试验与血凝抑制试验时，两者使用的缓冲液存在明显差异，常见的缓冲液包括两种，第一种生理盐水；第二种磷酸盐缓冲液。

在常规的禽流感抗体检测检验中，会选用浓度85%的生理盐水作为缓冲液，因为当生理盐水的浓度超过85%后，容易导致红细胞出现非特异性凝集，但是生理盐水并不能持续具备反应系统pH值的能力。而磷酸盐缓冲液具备此能力。利用磷酸盐缓冲液展开禽流感抗体检测，获取的抗体效价与利用生理盐水相较，体现出明显的检出率优势。基于此，禽流感凝血实验与凝血抑制检测实验最佳的缓冲液应为磷酸盐。明显提升检出率的同时，有效避免了非特异性凝聚。需要特别指出的是，与磷酸盐配合使用的Na2HPO4含有水分子，应合理把控用量，在灭菌处理后还需要对pH值进行调整。

2.1.2 缓冲液的pH值。无论在试验过程中选用哪种缓冲液，都应注意合理pH值的设定。病毒血凝性最适宜的pH值应控制在6.0～7.2之间。当pH＜5.8时，红细胞增加了聚集结块风险，或者会发生破裂溶血现象。pH＞7.8时，聚集红细胞发生加速解聚变化，导致原本吸附在红细胞上的病毒脱落。如果使用生理盐水为缓冲液，7.2＜pH＜6.4时，容易导致红细胞破溃溶血问题的发生。综合来讲，利用磷酸盐缓冲液展开试验时，最佳的pH值范围为：6.0＜pH＜7.2，而生理盐水为缓冲液展开试验时，最佳的pH值范围为：6.4＜pH＜7.2。所以，为提升试验结果精准性，可以将pH值确定在6.4～7.2之间，当pH值被确定在7.0～7.2之间时，血沉是最充分的，试验中图形的可辨性也是最高的，直接通过观察可以完成精准性较高的结果判定。出于pH试纸存在误差的考虑，可以在试验过程中将pH值控制在7.0，此措施的有效性在众多的试验检测中已经得到验证。

2.1.3 缓冲体系统一。在整体试验过程中，当涉及缓冲液使用时，应确保使用的缓冲液统一，特别是在1%鸡红细胞配置过程中，一定要避免生理盐水的使用，应严格按照试验所需的缓冲体系实施操作。

2.2 温度的控制

在展开HA和HI操作时，温度的精确控制也是提升检测准确率的有效方法。当试验温度处于4～37℃范围内时，当温度提升5℃时，HI效价会明显发生改变，平均提升0.35㏒2。当环境温度达不到4℃时，会导致反应速度下降，应对反应时间适当延长。此时的红细胞非常容易发生聚集。当环境温度高于37℃时，抗原能活跃，会大量释放神经氨酸酶，导致红血球表面因为受到破坏而丧失聚散能力，最终从红血球上脱落，最终导致溶血的发生。当温度高于37℃时，容易因为液体蒸发过快而对反应体系、各组比例造成影响，反应体系与比例失调都会直接影响到抗原活性——下降，造成试验失效的严重后果。综前所述，试验的最佳温度应控制在18～22℃之间，特别是在炎热的夏天展开试验时，应先将试验环境衡定在恰当温度范围内再展开试验。

2.3 时间的控制

在进行测定血凝效价后，很多情况会对持续展开HI试验产生制约，具体情况包括：隔天展开HI试验、进行了红细胞悬液的更换、进行了抗原的更换。当上述三种情况发生时，都需要对血凝效价进行重新测定。常规情况下，在HA试验加入红细胞20min后，可以随时读取观察结果，直到对照孔出现100%凝集现象，空白对照孔的液体足够清澈透亮后，再完成结果的最终判定。

在展开HI试验过程中，孵育过程的时间与温度成反比，最适宜试验展开的温度值为18～22℃之间，孵育在20～40min之间。当孵育时间不足，会导致血清中的抗体与抗原之间的反应不彻底，凝聚欠佳，导致后续红细胞与血清中的抗体进行抗原争夺。当孵育时间太长，抗原会释放出大量神经氨酸酶，对红细胞造成严重影响，致其脱落或裂解。所以，将孵育时间控制在20min，以阴性与阳性的对照孔反映情况为信号，阴性对照孔表现出完全沉淀，阳性对照孔表现出凝集时，对试验结果进行观察。泪滴彻底流淌，与对照孔的泪滴大小、泪痕流动速度、泪线粗细非常相似时，最后孔作为判定结果。