3种不同染色方法对肺组织弹力纤维染色效果的影响

王鹏程， 陈林莺， 翁丹枫， 张 声， 李国平

弹力纤维是结缔组织中重要的纤维之一，其主要的化学组成为弹性蛋白，弹性蛋白提供了弹力纤维的弹性。弹力纤维广泛分布于身体的各器官及组织，主要存在于肺、心脏、血管、皮肤等部位中，富有弹性，极难溶解，新鲜时呈黄色，折光性强，常规H-E染色下呈现不同程度的红色，不易与胶原纤维等组织区分，只有用特殊染色方法才能清楚显示[1-2]。弹力纤维的染色方法较多，操作繁简不一，染色结果参差不齐，笔者所在科室经过多年实践，积累了一些染色经验。现将Gomori醛复红法进行改良，并与Verhoeff铁苏木精法和Weigert间苯二酚复红法进行比较[3]，旨有探讨改良Gomori醛复红法在肺组织弹力纤维染色的应用意义。

1 材料与方法

1.1材料 收集送检的住院手术患者的肺组织30例，均用体积分数为4%中性缓冲甲醛液固定(pH=7.2)，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片。

1.2主要试剂

1.2.1Verhoeff铁苏木精液 (1)苏木精5 g充分溶于100 mL无水乙醇；(2)质量分数为10%的氯化铁：氯化铁10 g充分溶于100 mL蒸馏水；(3)Lugol碘液；碘1 g和碘酸钾2 g充分溶于100 mL蒸馏水。取上述3种溶液各20，8，8 mL混匀得到Verhoeff工作液。质量分数为2%的三氯化铁：三氯化铁2 g充分溶于100 mL蒸馏水。

1.2.2Weigert间苯二酚复红液 在100 mL蒸馏水中分别加入碱性品红1 g、间苯二酚2 g，加热煮沸，再缓慢加入12.5 mL 30%三氯化铁，继续加热煮沸5 min，冷却后过滤，将沉淀物溶于100 mL体积分数为95%的乙醇，最后加入2 mL浓盐酸。

1.3方法

1.3.1Verhoeff铁苏木精法 石蜡切片脱蜡至水；Verhoeff工作液染30 min，蒸馏水快速冲洗；2%氯化铁分化至弹力纤维呈黑色，背景呈灰色，蒸馏水快速冲洗；95%乙醇快速冲洗，用Van Gieson液复染30 s，滤纸吸干多余的染液；梯度乙醇快速脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.3.2Weigert间苯二酚复红法 石蜡切片脱蜡至水；95%乙醇2 min；Weigert间苯二酚复红液1～2 h；直接用95%乙醇洗去多余的染液至无余色脱下，蒸馏水冲洗；用Van Gieson液复染30 s，用滤纸吸干多余的染液；梯度乙醇快速脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.3.3改良Gomori醛复红法 石蜡切片脱蜡至水；用酸性高锰酸钾氧化5 min，蒸馏水稍洗；2%草酸漂白1 min，流水冲洗5 min；70%乙醇稍洗；用Gomori醛复红液染色15～20 min，用70%乙醇浸洗2次，至切片不再脱色为止，蒸馏水稍洗；用1%亮绿复染1 min，蒸馏水稍洗；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

1.4结果判读 组织学染色结果判断标准采取单盲法，由3位高年资病理医师审核具体评分(表1)。

表1 组织学评分标准

1.5统计学处理 采用GraphPad Prism 5软件分析数据。两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

Verhoeff铁苏木精法弹力纤维呈黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色；Weigert间苯二酚复红法弹力纤维呈棕色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色；改良Gomori醛复红法弹力纤维呈深紫色，背景呈绿色。将3种弹力纤维染色结果两两比较，差别均具有统计学意义(P<0.05)。改良Gomori醛复红法较其他两种方法操作简单，定位准确，背景清晰，对比更明显(图1，2)。

本研究中3种方法的染色积分情况分别为(9.87±2.63)，(5.35±1.26)和(6.28±2.13)，进行两两比较，结果显示改良Gomori醛复红法的得分明显高于其他两组(P=0.009, 0.012)。

3 讨 论

病理学检测技术在病理诊断中具有举足轻重的作用，已然成为诊疗疾病和判断预后不可或缺的检查手段之一。弹力纤维主要存在于皮肤、气管、支气管、肺泡、心血管、韧带等处，弹力纤维染色可用于判断组织中弹力纤维是否存在增生或者断裂，具有重要的病理诊断以及鉴别诊断意义[4]。弹力纤维对肺组织中的细支气管和肺泡壁具有支撑作用，为此，弹力纤维染色常用于一些呼吸系统疾病的鉴别诊断，比如支气管扩张、肺气肿、肺纤维化中弹力纤维蛋白的差异具有不同表现。此外，弹力纤维染色还有助于判断是否侵犯脏层胸膜，用于区分原位癌与浸润癌。由于常规的H-E染色中细胞间质均呈不同程度的粉红色至红色，不易与其他纤维组织区分开来，往往需要采用特殊的染色方法才能更好地确定弹力纤维变化情况[5]。

弹力纤维的染色方法众多，有醛复红法、间苯二酚碱性品红法、地衣红法、稀释间苯二酚碱性品红法、维多利亚蓝法、铁碘苏木精法等，部分方法染色需要较长时间，有的甚至需要过夜，操作繁琐、费时，不宜在临床工作中应用，常规的病理检验常采用醛复红染色方法[6-8]。笔者所在科室经过多年实践积累，对肺组织弹力纤维染色有了一定的认识和体会，对Gomori醛复红染色方法进行了改良，并与Verhoeff铁苏木精法和Weigert间苯二酚复红法进行比较。改良Gomori醛复红法中醛复红对特殊的蛋白及含硫酸根的黏多糖有很强的亲和力，与弹性蛋白结合牢固，同时改用酸性高锰酸钾氧化后，其氧化能力明显增强，比传统醛复红法中的Lugol碘液更强，可明显提高耐酸纤维及前弹力纤维的染色效果[9-11]。高锰酸钾见光易分解变质，宜用棕色试剂瓶保存。醛复红液的配制相对简单，1～2 d即可成熟，成熟后过滤至试剂瓶中放置于4 ℃冰箱保存备用，使用时恢复至室温染15～20 min(冬季可适当延长染色时间)。Verhoeff铁苏木精法是弹力纤维经典的染色方法之一，虽该法操作简单、染色时间相对较短、不易褪色、粗纤维着色较深，但是较细的两种纤维染色相对差，铁碘苏木精配制较繁琐，染色没有选择性，细胞核和胶原纤维也可以有不同程度的着色，且分化程度不易掌握和判断，需在显微镜下进行控制[12-13]。Weigert间苯二酚复红法对于较细的弹力纤维染色不明显，对比不清晰，而且Weigert间苯二酚复红法中间苯二酚碱性品红液配制相对复杂，需要加热，所需试剂种类较多，相较其他两种方法染色时间更长，需1～2 h，初学者不易掌握。改良Gomori醛复红染色液是碱性品红加入三聚乙醛和盐酸配制而成的，盐酸是酸性催化剂，可使三聚乙醛解聚产生乙醛，具有更高活性的乙醛与碱性品红染料的氨基发生反应，从而产生偶氮甲碱，颜色转变为深紫色，说明染液已成熟。成熟的染液对特定的蛋白及含硫酸根的黏多糖具有很强的亲和力，可与弹力纤维紧密结合。3种方法虽然均能染出肺组织弹力纤维，但从染色方法及效果可以看出，改良Gomori醛复红染色法能够较好地染出肺组织弹力纤维的形态变化，而且操作简单，背景干净，对比明显，易于观察，是目前肺组织弹力纤维最佳的染色方法。在实验过程中，改良Gomori醛复红法应注意醛复红液为70%乙醇配制，在实际的染色操作中需注意防止干片，最好采用油性笔画线、放入湿的孵育盒或者浸染，70%乙醇分化至肉眼下无色为止，不可过度分化，防止弹力纤维褪色，必要时在显微镜下控制分化效果。由于Weigert间苯二酚复红法用Van Gieson液复染时间比较短，不易掌握，很容易过染而覆盖弹力纤维的颜色，黄色和棕色对比不明显，且Van Gieson液复染后易褪色，不利于切片的保存，给回顾性研究造成困难。改良Gomori醛复红法改用亮绿复染，时间稍长，比较容易控制，绿色和紫色对比更明显，且亮绿不易褪色，保存时间久，但亮绿也要淡染，不可因染色过度而覆盖弹力纤维染色，从而影响观察及对比[14-16]。操作过程中也不能忽视常规H-E染色或者其他检查的重要性，只有在观察H-E染色后怀疑弹力纤维病变或者某些诊断需要辅助诊断时才做该染色加以证明。

笔者认为，改良后的Gomori醛复红方法操作简单，背景清晰，对比明显，结果可靠，是目前肺组织弹力纤维染色最佳的染色方法，值得在临床病理工作中推广应用。