盘县火腿自然发酵过程中理化和风味特征

郑璞 苏伟 母雨 母应春

摘 要：分析盘县火腿自然发酵过程中理化特性和风味特征的变化，并结合香气活度值（odor activity value，OAV）和偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析确定盘县火腿主体香气成分。结果表明：盘县火腿理化特性在发酵过程中发生显著变化（P<0.05），pH值和NaCl含量显著上升，而水分活度、水分含量和肌内脂肪含量显著下降，亮度值和黄度值呈持续下降趋势，而红度值先降低后升高;随着发酵的进行，盘县火腿中风味物质的种类从25 种增加至40 种，含量从（218.50±22.14） ?g/kg上升至（1 044.49±51.47） ?g/kg，其中醛类物质的种类和含量最丰富;OAV分析筛选出16 种主体香气物质，PLSR模型显示3-甲基丁醛、十二醛、十六醛、（Z）-9-十八烯醛和十八醛对盘县火腿肉香、清香和油脂香有显著贡献。

关键词：盘县火腿;理化特性;香气活度值;偏最小二乘回归;主体香气成分

Abstract： This work analyzed the changes in the physicochemical properties and flavor characteristics of Panxian ham during natural fermentation. The main flavor components were determined based on odor activity value （OAV） and partial least squares regression （PLSR）. The results showed that physicochemical properties significantly changed during fermentation （P < 0.05）. Specifically， the pH and NaCl content increased significantly， while the water activity， water content and intramuscular fat content significantly decreased. The L* and b* values showed a continuous downward trend， while the a* value first decreased and then increased. As fermentation proceeded， the number and amount of flavor compounds increased from 25 to 40， and from （218.50 ± 22.14） to （1 044.49 ± 51.47） ?g/kg， respectively， with aldehydes being the most diverse and abundant class. Based on OAV， 16 main flavor compounds were identified. And the PLSR model showed that 3-methyl butyraldehyde， dodecyl aldehyde， hexadecanal， （Z）-hexadec-9-enal， and gamma-nonanolactone were significantly related to the meaty and fatty aroma as well as faint scent of Panxian ham.

Keywords： Panxian ham; physicochemical properties; odor activity value; partial least squares regression; main flavor components

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200615-152

中圖分类号：TS251.6                                       文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）09-0059-09

引文格式：

郑璞， 苏伟， 母雨， 等. 盘县火腿自然发酵过程中理化和风味特征[J]. 肉类研究， 2020， 34（9）： 59-67. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200615-152.    http：//www.rlyj.net.cn

ZHENG Pu， SU Wei， MU Yu， et al. Physicochemical and flavor characteristics of Panxian ham during natural fermentation[J]. Meat Research， 2020， 34（9）： 59-67. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200615-152.    http：//www.rlyj.net.cn

干腌火腿作为传统发酵肉制品，被誉为肉中之王，具有悠久的加工和消费历史。盘县火腿是我国著名的干腌火腿之一，据了解，盘县火腿的腌制工艺已经有600 年历史，悠久的加工历史使得盘县火腿的加工工艺成熟，并在当地形成丰富的微生物群，为火腿的自然发酵奠定了优良基础。盘县火腿继金华火腿和宣威火腿之后获得“国家地理标志产品”称号，具有肉色鲜艳、腿心丰满、香气浓郁、口感细腻等品质特征，深受消费者喜爱[1]。

火腿理化特性的改变不仅可能影响蛋白质水解、脂解和脂质氧化等生化反应，还可能损害微生物群落结构的稳定，从而影响其保质期和挥发性风味[2];而风味在腌肉制品的感官接受度上起着关键作用，决定着产品的潜在经济价值。因此，许多学者分析了干腌肉制品发酵过程中理化性质及风味物质的变化。Giovanelli等[3]比较帕尔马、圣丹尼和托斯卡诺火腿发酵过程中理化、形态和芳香特征的演变;Lorenzo[4]研究干腌马肉制作过程中理化、质地及香气成分的变化;耿翠竹[5]分析宣恩火腿加工过程中理化性质和风味的动态变化。

干腌火腿的风味形成途径主要包括脂质氧化、蛋白质分解、氨基酸Strecker反应、美拉德反应、硫胺素降解及微生物作用等[6]。近年来，越来越多研究证明干腌火腿的风味品质受许多因素影响，包括加工工艺、猪品种、性别及饲料[7-8]等。因此，不同类型的干腌火腿在风味上存在很大异质性。为了解干腌火腿的风味品质，国内外学者多采用仪器分析进行研究[9-10]。然而，人的感官对某些风味的灵敏度超过现代最灵敏的分析仪器，将感官分析与仪器分析结合起来是目前食品风味研究的热点之一[11-12]。Górska等[13]结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPEM-GC-MS）和感官评价揭示干腌火腿风味的主要来源;周文杰等[14]通过感官属性与主体风味的偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）模型明确了各种挥发性成分对梨酒风味的贡献程度;肖作兵等[15]利用基于香气活力值（odor activity value，OAV）和香气提取物稀释分析的PLSR模型筛选出工夫红茶中22 种关键香气物质。

有研究揭示了盘县火腿自然发酵过程中微生物的群落演替规律和代谢产物的动态变化，但并未对此过程中理化特性和风味特征的变化进行分析[16]。因此，本研究以6 个不同加工阶段的盘县火腿为研究对象，分析各理化特性的变化规律，应用HS-SPEM-GC-MS检测挥发性风味物质并进行OAV分析，然后建立PLSR模型，明确主体风味对感官属性的贡献程度，以期为盘县火腿品质的提升提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取30 条10～12 kg的新鲜猪腿，购自贵州省盘州市昊霖食品有限公司，样品购置后24 h内运回实验室并保存于-20 ℃冻库。

硝酸银 国药集团化学试剂有限公司;铬酸钾 天津市科密欧化学试剂有限公司;硝酸 重庆川东化工有限公司;石油醚 成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CR-200色差仪 日本柯尼卡-美能达公司;PHS-3C pH计 上海佑科仪器仪表有限公司;HD-6水分活度仪 无锡市华科仪器仪表有限公司;SER148脂肪测定仪 嘉盛（香港）科技有限公司;Trace1300-TSQ8000气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 盘县火腿的制作

选取30 条10～12 kg的新鲜猪腿，按照传统工艺制作盘县火腿，包括成熟、腌制、静置和熟化。生火腿经过24 h的成熟，然后用海盐在4 ℃的冷库中腌制。火腿共经历3 次腌制。第1次的盐用量为火腿质量的4%，腌制时间为3 d，第2次和第3次的盐用量为火腿质量的2%，腌制时间分别为3 d和15 d，整个腌制过程持续21 d。腌制好后，洗净残留在火腿表面的盐和血水。然后，将火腿转移到10～15 ℃、相对湿度75%～80%的房间中静置30 d。最后，将火腿挂在20～22 ℃、相对湿度65%～70%的发酵室中，直至完全成熟。

1.3.2 采样

在整个火腿加工过程中的6 个不同阶段采集30 只火腿的股二头肌：生火腿（1 d）、腌制期（21 d）、静置期（51 d）、成熟初期（180 d）、成熟中期（360 d）和成熟末期（540 d），每个阶段随机抽取5 只火腿。去除皮下脂肪和结缔组织后，将样品真空包装并贮藏于-80 ℃，待分析。

1.3.3 理化指标测定

水分含量测定：直接干燥法;NaCl含量测定：采用国标法（GB 5009.44—2016《食品安全国家标准 食品中氯化物的测定》）;水分活度（water activity，aw）测定：将样品切碎，取20 g于水分活度仪传感器中测定10 min后记录数据;pH值测定：样品切碎后取5 g于烧杯中，加入45 mL蒸馏水，充分搅拌后过滤，用pH计测定滤液pH值;肌内脂肪含量测定：使用脂肪测定仪测定;色度值（亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*））测定：使用便携式色差仪，按照说明书进行测定。所有实验重复3 次。

1.3.4 挥发性风味物质测定

1.3.4.1 风味化合物的提取与检测

参照Maru?i?等[17]的方法提取和检测挥发性风味化合物，并略作修改。准确称取5.00 g切碎的火腿样品置于25 mL饱和食盐水中，均质2 min制备火腿匀浆。取10 mL匀浆置于20 mL顶空瓶中，加入20 μL 1.2 mg/L 4-甲基-2-戊醇作内标，并用聚四氟乙烯隔膜盖紧，然后使用已老化的50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取头在40 ℃振摇提取180 min。萃取完成后，立即将SPEM纤维插入进样口，在230 ℃条件下解析5 min。

色谱条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載气为氦气，流速1.0 mL/min，不分流模式。柱升温程序：50 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min速率升至200 ℃，最后以20 ℃/min速率升至250 ℃并保持10 min。

质谱条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV，传输线和离子源温度分别为280 ℃和230 ℃，扫描范围50～450 u。

1.3.4.2 风味化合物的定性与定量分析

定性分析：将实验结果与NIST数据库进行比对，仅保留正反匹配度均大于800的化合物。在相同的色谱条件下运行测定C6～C30正构烷烃混合标品，以计算化合物的保留指数（retention index，RI），RI按式（1）计算。

1.3.5 感官评价

参考高韶婷[18]的方法，从肉香、清香、油脂香、酸味和腌制味方面对不同阶段盘县火腿进行感官评价。基于定量描述分析方法，10 位经过培训的评价员（22～28 岁）采用9 分标度法（1=极弱，9=极强）对不同发酵阶段的盘县火腿进行感官评价，并记录结果。

1.4 数据处理

数据用平均值±标准差表示，采用SPSS Statistics 20.0软件进行数据的统计分析，利用单因素方差分析得出显著性差异水平（P<0.05）;采用Unscrambler 9.7软件进行PLSR相关性分析。

2 结果与分析

2.1 盘县火腿加工过程中理化特性的变化

理化性质对最终产品的感官特性有重要影响。pH值与肉的持水能力和肌肉蛋白的水解有关，原料腿的pH值对产品品质至关重要，pH值过高或过低均会导致产品缺陷。由表1可知，生火腿的平均pH值在正常范围内[19]。在整个加工过程中，盘县火腿pH值从5.74显著上升至5.94（P<0.05），但仍属于微酸环境，这有利于抑制有害微生物的生长繁殖。Bermúdez等[20]在塞尔塔干腌火腿加工过程中观察到类似的趋势，火腿pH值为5.56～5.98。干腌火腿加工过程中pH值的上升可能与细菌的生长繁殖[21]和蛋白降解为游离氨基酸[22]有关。

aw是影响微生物生长的重要指标，Losantos等[23]报道了aw的下降对干腌火腿中腐败微生物的强烈抑制作用。本研究中生火腿的平均aw（0.977）与金华火腿（0.974）[24]接近。盘县火腿aw在整个加工过程中显著下降（P<0.05），加工过程结束时，成熟火腿的aw（0.753）远低于金华火腿（0.865），但高于发酵12 个月的三川火腿（0.65）[25]。这种差异可以归因于盐用量和成熟时间，因为盐渗透压和高温成熟导致强烈脱水[26]。

盘县火腿水分含量的变化趋势与aw一致，在整个过程中显著降低（P<0.05）。本研究中生火腿的水分含量略高于意大利圣丹尼尔（prosciutto di San Daniele，PDO）火腿（71.12%），但最终产品的水分含量却远低于PDO火腿（54.68%～55.29%）[3]，这可能是因为盘县火腿较长的加工时间导致更多的水分流失。

与意大利PDO火腿类似，本研究原料腿中的初始NaCl含量低于检出限[3]。腌制后盘县火腿NaCl含量快速上升，并持续增加至成熟结束，这是由于加工过程中NaCl不断向火腿内部渗透和火腿持续失水所导致的。最终的NaCl含量（5.28%）与三川火腿（4.93%）[27]和挪威火腿（5.42%）[28]接近，但远小于加工20 个月的塞尔塔火腿（15.87%）[26]。一些研究已经证明高钠饮食与血压升高、心血管和肾脏疾病有关[29]。因此，较低盐含量的干腌火腿更容易获得消费者的青睐。

肌内脂肪含量是决定干腌肉制品质量的主要因素之一，影响盐/水扩散和干燥过程的调节[30]。此外，肌内脂肪含量还对干腌火腿的整体风味起着至关重要的作用，伊比利亚火腿[2]和塞拉诺火腿[31]分别有20、28 种挥发性风味物质受肌内脂肪含量的影响。在整个加工过程中，盘县火腿肌内脂肪含量显著下降（P<0.05），与Bermúdez等[26]在塞尔塔火腿中观察到的情况一致，他们认为这种下降是由于腌制和后腌制阶段样品中NaCl含量的增加和渗透所致，这将导致脂肪对样品总固形物含量的贡献大大降低。

颜色是干腌火腿最重要的外观特征之一[32]，可能会影响消费者的购买欲望。盘县火腿L*、a*和b*在加工过程中均发生显著变化（P<0.05），其中L*和b*呈持续下降趋势，而a*呈先下降后上升的趋势，这与金华火腿加工过程中的颜色变化类似[24]。不同的是，在塞尔塔干腌火腿加工过程中观察到L*、a*和b*均呈下降趋势，这可能与水分含量的减少、环境温度、盐含量和pH值的增加有关，环境温度高不仅有利于微生物的生长繁殖和酶的活动，而且可促进氧化。因此，温度较高会加快肉发生色变及腐败，温度较低，空气流动快，可促使高铁肌红蛋白的形成，加速肉色褐变。空气中氧浓度较高，会加速肉的氧化，从而使肉发生色变[20，26]。

2.2 盘县火腿加工过程中挥发性风味化合物分析

风味是干腌火腿最重要的指标之一，不同的挥发性物质组成赋予产品不同的风味特征，干腌火腿的风味研究对其品质评价具有重要意义。由图1和表2可知，盘县火腿中共检出50 种挥发性风味物质，包括醛类24 种、醇类9 种、酮类7 种、酸类7 种、其他类3 种。

在整个加工过程中，醛类物质含量显著增加（P<0.05），从187.71 ?g/kg增加至876.78 ?g/kg，是盘县火腿中最具代表性的风味成分，与国内外著名干腌火腿的报道类似[33-34]。醛类化合物大部分来源于不饱和脂肪酸的氧化，少部分由美拉德反应生成，此类物质阈值较低，一般具有水果味，是火腿风味成分中最重要的一类化合物[35]。直链醛是脂质氧化的典型产物，己醛、壬醛和十六醛是盘县火腿中含量最丰富的醛类物质，它们也是伊斯特拉火腿的典型特征风味物质[36]。其中，己醛是由n-6脂肪酸（如亚油酸和花生四烯酸）氧化得到的，具有青草香气，但过量会导致腐败臭味[35];壬醛是油酸的氧化产物，有助于增加甜味和果味香气[37];而具有肉香味的十六醛是巴马火腿的主要成分[38]。关于不饱和醛，在盘县火腿整个加工过程中鉴定出10 种，包括3 种多不饱和醛，这是由于脂肪酸氧化所致。与线性醛不同，支链醛和芳香醛主要来源于氨基酸的Strecker降解。在盘县火腿整个加工过程中，共鑒定出1 种支链醛（3-甲基丁醛）和3 种芳香醛（苯甲醛、苯乙醛和4-戊基-苯甲醛）。3-甲基丁醛与坚果味和橡子味有关，是成熟伊比利亚火腿中最丰富的风味物质[39]，但高含量的苯乙醛被认为是伊比利亚火腿腐败的特征[40]。

醇类物质的形成与脂质氧化、氨基酸代谢、甲基酮还原和微生物繁殖密切相关。线性醇通常由脂质氢过氧化物的降解产生，它们的气味阈值通常很高，因此对香气的影响很小，而支链醇主要来自于微生物代谢。本研究共鉴定出9 种醇，含量最丰富的是1-辛烯-3-醇，与Radov?i?等[41]的报道一致，但其仅在成熟过程被检测到。1-辛烯-3-醇是由花生四烯酸氧化形成的，具有较低的阈值，呈典型的蘑菇味，已被鉴定为金华火腿和如皋火腿的气味活性成分[42]。

酮类化合物可通过脂质自氧化作用和微生物代谢产生[43]。对干腌火腿香味有重要影响的酮类物质主要是甲基酮，其是在大量微生物存在下通过化学反应形成的，是β-酮酸脱羧或饱和脂肪酸β-氧化的产物。盘县火腿酮類物质含量较低（0.79～23.29 ?g/kg），且未检出甲基酮，但酮类物质含量在成熟初期急剧减少，其可以转化为一些羧酸和其他风味物质，表明酮类物质可能对盘县火腿的整体风味起着前体作用。

酸类化合物是干腌火腿中的重要挥发性成分，可能来源于甘油和磷脂的氧化降解、美拉德反应或醛类物质的高温氧化。在火腿成熟过程中，酸类物质含量一般呈上升趋势。在本研究中，盘县火腿的酸类物质含量为3.23～43.65 ?g/kg，占成熟盘县火腿风味物质总含量的4.03%，该占比与北欧火腿[44]类似，但低于金华火腿[45]。短链酸由于其低嗅觉阈值而在香气形成中起重要作用，而较长链的酸，如辛酸具有较高阈值，不会直接影响火腿的风味感知，但其可能作为其他挥发性化合物的前体[46]。

盘县火腿中共检出3 种其他类物质，包括2 种烃类物质和1 种吡嗪类物质。烃类化合物广泛存在于干腌火腿中，主要由脂质氧化形成，具有较高阈值，对干腌火腿整体香气贡献较小。吡嗪类化合物主要来自于美拉德反应，是干腌火腿中重要的挥发性风味物质，通常赋予肉品坚果及烘烤香味[47]。

2.3 OAV法鉴定盘县火腿关键香气成分

香气成分对食品整体风味的贡献不仅与其含量有关，还与其香气阈值有重要关系，有时含量小的风味成分可能对风味品质起着至关重要的作用，而一些含量丰富的物质却没有贡献。OAV可以从含量和香气阈值两方面揭示香气物质对产品总体香气的贡献，已广泛应用于食品领域，一般认为OAV不小于1的物质是产品的关键香气成分。

根据相关文献中部分化合物的香气阈值计算OAV，由表3可知，共筛选出16 种OAV≥1的香气物质，包括13 种醛类、2 种醇类和1 种酮类物质。类似地，刘登勇[42]在金华火腿、宣威火腿和如皋火腿中共鉴定出17 种主体风味物质，包括9 种醛类。干腌火腿中鉴定出的挥发性风味物质已达数百种，涉及10余个类别，但由于较低的嗅闻阈值，醛类物质对火腿风味品质的形成起着至关重要的作用，被认为是干腌火腿中最重要的一类挥发性化合物。一般来说，3～4 个碳原子的直链饱和/不饱和醛具有强烈的刺激性气味，5～9 个碳原子时具有清香、油香、脂香气息和腐臭气味，10～12 个碳原子时具有柠檬味和桔子皮味[53]。

2.4 盘县火腿感官属性与关键香气物质的PLSR分析

对盘县火腿不同加工阶段的感官属性（肉香、清香、油脂香、腌制味和酸味）进行感官评定，由图2可知，肉香、清香、油脂香和腌制味在不同样品间存在极显著差异（P<0.01），但酸味不具有显著差异。腌制味在静置期（51 d）样品中得分最高，清香属性在成熟中期（360 d）样品中得分最高，而成熟末期（540 d）样品具有最明显的肉香和油脂香。类似地，高韶婷[18]发现，金华火腿、宣威火腿和如皋火腿的肉香、油脂香和腌制味最浓，而党亚丽等[54]认为，浓厚的清香和酸味也是金华火腿的特征。

为进一步揭示盘县火腿感官属性与挥发性风味化合物之间的关系，以挥发性风味化合物为X矩阵，以感官属性为Y矩阵，建立PLSR回归分析模型，筛选出对各个感官属性有显著贡献的特征香气物质。由图3可知，在5 种感官属性中，肉香、清香和油脂香与挥发性风味物质具有显著相关关系，而腌制味和酸味与50 种挥发性风味物质均无显著相关关系。具体而言，3-甲基丁醛和十二醛与肉香属性呈显著正相关;十六醛、（Z）-9-十八烯醛和十八醛与肉香和清香属性均呈显著正相关;3-甲基丁醛和十三醛与油脂香属性显著相关，其中3-甲基丁醛呈显著正相关，而十三醛呈显著负相关。党亚丽[55]用蒸馏萃取和SPME法提取火腿中的挥发性风味物质，用GC-MS仪对其进行分析，也在金华火腿和巴马火腿中检测出十六醛，火腿呈现出肉香和油脂香。

3 结 论

以6 个不同阶段的盘县火腿为实验材料，揭示自然发酵对盘县火腿理化性质和风味特征的显著影响（P<0.05）。与生火腿相比，成熟盘县火腿具有较低的水分活度（0.753）、水分含量（43.93%）及适宜的盐含量（5.28%），有助于抑制腐败和有害微生物的生长繁殖;而较高的a*（18.65）、较低的L*（32.70）和b*（7.01）显示出成熟盘县火腿良好的颜色属性。

HS-SPEM-GC-MS法共检出50 种香气物质，其中生火腿25 种，成熟火腿40 种，含量分别为218.50、1 044.49 ?g/kg，表明自然发酵有助于盘县火腿风味品质的形成。通过OAV分析筛选出16 种关键风味物质，PLSR回归模型表明，OAV≥1的3-甲基丁醛和十二醛与肉香和油脂香显著相关，而未计算OAV的十六醛、（Z）-9-十八烯醛和十八醛与肉香和清香属性均呈显著正相关。因此，单纯采用OAV法确定盘县火腿特征风味存在一定的局限性，应结合PLSR回归模型进行更全面的筛选。

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