胎膜TRAIL表达水平及血液相关炎性标志物水平在胎膜早破发生中的作用与关系

吴兆晴 玉姣 李晓琼 周文丽 张曙萱

[摘要] 目的 探讨胎膜中肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）水平与血清炎性标志物水平在胎膜早破发病机制中的作用及关系。 方法 选取2019年1—12月江苏省淮安市妇幼保健院收住的80例胎膜早破产妇为研究对象，根据破膜孕龄将其分为足月胎膜早破组（孕龄≥37周，46例）、早产胎膜早破组（孕龄28～36+6周，34例）。选取同期80名足月胎膜完整产妇作为对照组。检测三组胎膜组织中TRAIL及血液中相关炎性标志物水平[中性粒细胞淋巴细胞比值（NLR）、血小板淋巴细胞比值（PLR）及淋巴细胞单核细胞比值（LMR）]并分析胎膜组织中TRAIL与炎性标志物水平相关性。 结果 早产胎膜早破组TRAIL阳性率，TRAIL mRNA表达水平，血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破组及对照组（均P < 0.05）;足月胎膜早破组TRAIL阳性率，TRAIL mRNA表达水平，血清NLR、PLR、LMR水平高于对照组（均P < 0.05）。胎膜组织中TRAIL表达水平与血清NLR、PLR、LMR水平呈正相关（r = 0.543、0.574、0.651，均P < 0.05）。 結论 TRAIL及血清相关炎性标志物在胎膜早破产妇胎膜中高表达，二者存在正相关。

[关键词] 胎膜早破;肿瘤坏死因子相关凋亡配体;中性粒细胞淋巴细胞比值;血小板淋巴细胞比值

[中图分类号] R714.433          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（c）-0024-04

The role and relationship between the expression level of TRAIL of fetal membranes and the level of blood-related inflammatory markers in the occurrence of premature rupture of membranes

WU Zhaoqing1   YANG Yujiao2   LI Xiaoqiong2   ZHOU Wenli2   ZHANG Shuxuan3

1.Department of Obstetrics， Xuzhou Medical University， Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province， Jiangsu Province， Huai′an   223002， China; 2.Department of Obstetrics， Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province， Jiangsu Province， Huai′an   223002， China; 3.Department of Obstetrics， Xuzhou Municipal Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou   221006， China

[Abstract] Objective To explore the role and relationship between the expression level of tumor necrosis factor-related apoptotic ligand （TRAIL） of membranes and serum inflammatory markers level in the pathogenesis of premature rupture of membranes. Methods From January to December 2019， 80 cases of premature rupture of membranes pregnant women admitted to Huai′an Maternal and Child Health Care Hospital of Jiangsu Province were selected as the research objects. They were divided into full-term premature rupture of membranes group （gestational age≥ 37 weeks， 46 cases） and preterm premature rupture of membranes group （gestational age 28-36+6 weeks， 34 cases）. 80 pregnant women of full-term fetal membranes were selected as control group in the same period. TRAIL in membranes tissue and blood related inflammatory markers （neutrophil lymphocyte ratio [NLR]， platelet lymphocyte ratio [PLR] and lymphocyte monocyte ratio [LMR]） were measured and the correlation between TRAIL and inflammatory markers in membranes tissue was analyzed. Results The TRAIL positive rate， TRAIL mRNA expression level and serum NLR， PLR， LMR levels in preterm premature rupture of membranes group were higher than those of full-term premature rupture of membranes group and control group（all P < 0.05）， and the TRAIL positive rate， TRAIL mRNA expression level and serum NLR， PLR， LMR levels in full-term premature rupture of membranes group were higher than those of control group （all P < 0.05）. TRAIL expression level in fetal membranes was positively correlated with serum NLR， PLR and LMR levels （r = 0.543， 0.574， 0.651， all P < 0.05）. Conclusion TRAIL and serum-related inflammatory markers are highly expressed in the membranes of women with premature rupture of foetal membranes， and there is a positive correlation between them.

[Key words] Premature rupture of membranes; Tumor necrosis factor-related apoptotic ligand; Neutrophil lymphocyte ratio; Platelet lymphocyte ratio

胎膜早破是围生期常见合并症之一，发病率为2.7%～7.0%[1]，可导致宫内感染、早产、胎盘早剥、胎儿窘迫[2]等发生，严重危害母儿生命健康。其发生原因及具体机制仍未完全明确，但是炎症、细胞凋亡在这一过程中起着至关重要的作用[3-4]。肿瘤坏死因子相关凋亡配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）具有调节细胞分化、凋亡及监视免疫反应等的作用，在胎膜早破的发病中发挥了重要作用[5-6]。为此，本研究选取了江苏省淮安市妇幼保健院（以下简称“我院”）产科收住的80例胎膜早破产妇，探讨胎膜中TRAIL水平与血液炎性标志物水平在胎膜早破发病机制中的作用。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1-12月我院收住的80例胎膜早破产妇为研究对象，根据破膜孕龄将其分为足月胎膜早破组（孕龄 ≥37周，46例）、早产胎膜早破组（孕龄28～36+6周，34例），选取同期我院80名足月胎膜完整产妇作为对照组。对照组年龄（27.76±3.52）岁;初产妇65名，经产妇15名。足月胎膜早破组年龄（28.05±3.69）岁;初产妇38例，经产妇8例。早产胎膜早破组年龄（27.28±4.19）岁;初产妇27例，经产妇7例。三组一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

纳入标准：①胎膜早破符合2015年中华医学会妇产科学分会产科学组《胎膜早破的诊断与处理指南》标准[7];②胎位正常、单胎妊娠，定期产检且产检资料完整，对照组胎膜完整且孕龄≥37周;③对本研究知情同意。排除标准：①临产或存在宫缩或存在胎位异常、骨盆狭窄、生殖道感染者;②经产妇有胎膜早破、子痫[8]、宫内感染、流产、死胎死产等不良妊娠史者;③存在妊娠高血压综合征、妊娠糖尿病、瘢痕子宫[9]、前置胎盘、妊娠合并心脏病、胎儿宫内窘迫、羊水异常等产科并发症、合并症者;④合并严重脏器功能不全、血液系统疾病、恶性肿瘤等基础疾病者;⑤既往有吸烟、嗜酒史，妊娠期間有口服药物史者。

1.2 方法

1.2.1 TRAIL测定  标本采集：取产妇胎膜破口处附近大小为20×20 mm2组织，分为两份，0.9%氯化钠溶液冲洗后大头针固定，一份置入冻存管投入液氮，一份置于10%甲醛溶液中固定。

TRAIL定性：取甲醛溶液固定的标本脱水，石蜡包埋，制成3 μm切片，冲洗，一抗为武汉博士德生物技术有限公司提供的兔抗人TRAIL抗体，采用免疫组化SP法[10]进行检测。阴性对照为磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗的结果。

TRAIL mRNA定量：取置入液氮的标本，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）法[11]进行检测：Trizol法提取组织中总RNA，反转录为cDNA，实时定量PCR，GAPDH为内参基因[11]。Trizol法：取1.5 mL EP管将标本置入，加入Trizol液1 mL充分匀浆、静置，加入氯仿0.2 mL，离心（4℃、12 000 g离心15 min）;取上清液加入异丙醇0.5 mL沉淀，再次离心（4℃、12 000 g离心10 min）;弃上清液加入75%酒精1 mL洗涤、离心（4℃、12 000 g离心5 min）;弃上清液加入20 μL H2O溶解RNA。反转录：提取的RNA作为RNA模板，加入引物合成与RNA模板互补的cDNA单链，形成DNA-RNA杂化双链，加入反转录酶水解为单链DNA，以单链DNA为模板合成另一条DNA链形成双链DNA。引物序列：TRAIL上下游引物序列分别为5′-AGAGGCACCACTAAAAGATCGC-3′和5′-GGTTTC-ACTATGTTGGTCACTATGG-3′，扩增产物133 bp;MMP-2上下游引物序列分别为5′-TGACGTGGACATCCG-CAAAG-3′和5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，扩增产物133 bp;GAPDH上下游引物序列分别为5′-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3′和5′-AGGGATG-ATGTTCTGGAGAG-3′，扩增产物226 bp。由上海生物工程有限公司合成引物。PCR的反应条件为95℃ 10 min、95℃ 30 s、60℃ 1 h，35个循环，重复3次。

1.2.2 炎性标志物测定  取研究对象入院时外周静脉血3 mL，血常规检测采用全自动血球分析仪（武汉盛世达医疗设备有限公司，型号：BC-5000），计算中性粒细胞淋巴细胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）、血小板淋巴细胞比值（platelet lymphocyte ratio，PLR）及淋巴细胞单核细胞比值（lymphocyte monocyte ratio，LMR）。

1.3 TRAIL阳性标准

双盲法在显微镜下进行观察，根据TRAIL阳性表达细胞百分比及显色深浅综合判定。阳性标准：根据阳性细胞百分比进行评分，无阳性细胞、阳性细胞 <10%、10%～50%、>50%～75%、>75%分别记为0、1、2、3、4分;根据显色深浅评分，细胞无显色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分;两项评分的乘积≤3分为阴性，4分为阳性，≥5分为强阳性[12]。阳性率=（阳性+强阳性）例数/总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验;胎膜组织中TRAIL水平和血清NLR、PLR、LMR水平的相关性分析采用Spearman等级相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床资料比较

早产胎膜早破组分娩孕龄、新生儿体重、5 min Apgar评分小于足月胎膜早破组、对照组，足月胎膜早破组5 min Apgar评分小于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。

2.2 三组胎膜组织TRAIL表达情况比较

早产胎膜早破组TRAIL阳性率、TRAIL mRNA表达水平高于足月胎膜早破组及对照组，足月胎膜早破组TRAIL阳性率、TRAIL mRNA表达水平高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

2.3 三组血清炎性标志物水平比较

早产胎膜早破组血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破组及对照组，足月胎膜早破组血清NLR、PLR、LMR水平高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表3。

2.4 胎膜组织中TRAIL水平与血清NLR、PLR、LMR水平的相关性

胎膜早破产妇胎膜组织中TRAIL水平与血清NLR、PLR、LMR水平呈正相关（r = 0.543、0.574、0.651，均P < 0.05）。

3 讨论

胎膜绒毛膜与羊膜之间的细胞外基质含有丰富的间质胶原纤维[13]，可适应妊娠期间不断增大的宫腔压力。一般而言，结构完整的胎膜是不会破裂的，但炎症反应等多种原因导致细胞外基质胶原代谢失衡，张力不够，宫腔压力增大则易形成胎膜早破。研究显示[14-16]，胎膜早破产妇破口处厚度下降35%，胶原纤维密度下降，结缔组织水肿，导致胎膜应力下降、羊膜和绒毛膜分离;胶原大量降解，导致羊膜细胞脱落、基底膜退化或损伤，而期间羊膜和绒毛膜无法有效重建，炎症细胞浸润，导致胎膜早破。此过程中，炎症反应、细胞凋亡起着至关重要的作用[17]。

TRAIL属于肿瘤坏死因子家族成员，广泛表达于宫颈、卵巢等各种细胞和组织，可作用于细胞增殖、分化、凋亡的过程，调节细胞凋亡、免疫监视等[18]。在稳定妊娠期间，TRAIL可有效维护胎膜的自我环境。研究显示[19-20]，妊娠晚期，TRAIL可在一定程度上表达于胎盘、胎膜，尤其是羊膜腔中。本研究结果显示，早产胎膜早破组TRAIL阳性率及TRAIL mRNA表达水平高于足月胎膜早破组及对照组（均P < 0.05）。提示胎膜早破尤其是早产胎膜早破产妇胎膜中TRAIL存在高表达，表明TRAIL与胎膜早破密切相关，其表达增高可能提示胎膜破裂的发生，甚至为胎膜早破的发病机制之一。其作用机制可能为TRAIL调控胎膜组织细胞的生长、凋亡，其表达升高，使组织活性细胞水平下降，影响细胞外基质沉积和胶原纤维合成[21-22]，从而导致胎膜结构发生变化，降低胎膜韧性、削减胎膜局部组织厚度。

炎症反应是胎膜早破尤其是未足月胎膜早破发生的重要原因。白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α等炎症因子结合后可引发炎症反应，诱导活性氧、胶原重塑[23-25]，从而影响胎膜结构，导致其破裂。本研究结果显示，早产胎膜早破组血清NLR、PLR、LMR水平高于足月胎膜早破组及对照组（均P < 0.05）。胎膜早破產妇NLR、PLR、LMR水平升高，提示机体发生炎症反应。TRAIL的升高可能与氧化应激、炎症反应等因素有关。当供氧、供血不足时，胎盘、胎膜组织可发生氧化应激，导致异常免疫反应，激发机体产生TRAIL;生殖道感染发生时，活化中性粒细胞，导致大量炎症因子释放，由于TRAIL具有监视免疫介导应答的作用，因此炎症反应发生诱发了TRAIL大量升高。本研究结果显示，胎膜组织TRAIL表达水平与血清NLR、PLR、LMR水平呈正相关。提示炎症反应是TRAIL升高的重要原因，NLR、PLR、LMR、TRAIL均参与胎膜早破发生。

综上所述，TRAIL在胎膜早破尤其是早产胎膜早破产妇胎膜中高表达，与血清炎性标志物存在正相关，二者共同参与了胎膜早破发生。

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（收稿日期：2020-06-08）

[基金项目] 江苏省妇幼健康科研项目（F201731）。

[作者简介] 吴兆晴（1973.9-），女，副主任医师;研究方向：母体医学。

[通讯作者] 张曙萱（1973.12-），女，博士，主任医师;研究方向：围生医学。