离子钛对致病疫霉生物活性的影响

朱雷 黄云 李洪浩

摘要：为明确不同浓度钛离子对致病疫霉菌丝生长、孢子囊释放游动孢子、游动孢子萌发和致病力等方面的影响，通过在含有不同浓度钛离子的黑麦蔗糖琼脂培养基上培养致病疫霉，以及配置含不同浓度离子钛的致病疫霉孢子悬浮液，分析离子钛对致病疫霉生长和致病力的抑制效果。结果表明，16 μg/mL钛离子处理对菌丝生长和孢子囊释放游动孢子具有较强的抑制作用，平均抑制率分别为95.77%、99.04%，而32 μg/mL钛离子处理对游动孢子萌发和致病力具有较强的抑制作用，平均抑制率分别为92.72%、91.11%。离子钛对致病疫霉菌丝生长、孢子囊释放游动孢子、游动孢子萌发和致病力等方面抑制效果与钛离子浓度成正比，这为马铃薯晚疫病环境友好型药剂的开发提供了理论依据。

关键词：离子钛;致病疫霉;生物活性;马铃薯晚疫病; 抑制作用

中图分类号： S435.32  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）20-0117-04

由致病疫霉[Phytophthora infestans （Mont.） de Bary]引起的马铃薯晚疫病是对马铃薯生产极具毁灭性的病害[1]。目前，马铃薯晚疫病仍以化学农药防治为主，由此导致的环境污染、粮食安全、病原菌抗药性[2]等问题尤为突出。《到2020年农药使用量零增长行动方案》的提出进一步提升了环境友好型农药研发的重要性。钛是地球表面分布较为广泛的元素之一，对促进植物生长，提高作物产量和品质有明显的作用[3]。钛元素通常以氧化物、硅酸盐结合态或钛铁矿存在，难以被植物吸收利用[4]。而由钛谷（天津）科技有限公司生产的离子钛（titanium ion of variable valence with light energy，简称TIVL）中钛元素以离子的形式存在，溶于水中，对多种细菌的生长具有抑制作用[5]。探讨离子钛对致病疫霉生物活性的影响，可以为研究其抑菌机制提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2019年在四川省农业科学院植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室完成。1.1 试验材料

1.1.1 供试试剂 离子钛由中国科学院成都生物研究所提供，钛离子母液浓度为4×103 μg/mL，用无菌水梯度稀释到320、160、80、40、20、10 μg/mL备用。

1.1.2 供试菌株 马铃薯致病疫霉采自四川省、贵州省、云南省、湖北省和重庆市马铃薯主产区，由四川省农业科学院植物保护研究所分离和保存，纯化、保存54份马铃薯致病疫霉。

1.1.3 供试培养基 黑麦蔗糖琼脂（rye sucrose agar，简称RSA）培养基：60 g黑麦，8 g琼脂，20 g蔗糖，蒸馏水定容至1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 致病疫霉分离培养 对分别采自四川省、贵州省、云南省、湖北省和重庆市马铃薯主产区的马铃薯晚疫病病叶进行消毒处理，取病健部1 cm2叶片置于已消毒的新鲜马铃薯薯片下，将放置有病样和薯片的培养皿置于18 ℃黑暗条件下，5 d后挑取薯片上菌丝于黑麦蔗糖琼脂培养基上，继续在18 ℃黑暗条件下培养。

1.2.2 致病疫霉菌悬液的制备 取致病疫霉菌落边缘1 cm2菌块，置于经消毒的新鲜马铃薯薯片下，于18 ℃黑暗条件下培养5 d后，挑取薯片上菌丝于无菌水中，振荡后经双层纱布过滤，获得致病疫霉孢子囊悬浮液，用血球计数板调整孢子囊浓度为 5×104个/mL。将致病疫霉孢子囊悬浮液置于6 ℃条件下3 h刺激孢子囊释放游动孢子，获得致病疫霉游动孢子悬浮液，并用血球计数板调整游动孢子浓度为1×105个/mL。

1.2.3 含钛平板和含钛菌悬液的制备 含钛黑麦蔗糖琼脂培养基平板的制备：在90 mm培养皿中分别加入160、80、40、20、10 μg/mL 离子钛1.5 mL与 13.5 mL 黑麦蔗糖琼脂培养基，充分摇匀后冷凝，使离子钛终浓度分别为16、8、4、2、1 μg/mL，以不含离子钛的培养基为对照。

含离子钛菌悬液的制备：在60 mm培养皿中先加入9 mL浓度为5×104个/mL的致病疫霉孢子囊悬浮液，再分别加入1 mL浓度为160、80、40、20、10 μg/mL 的含离子钛溶液，以不含离子钛的无菌水为对照，分别获得离子钛浓度为16、8、4、2、1、0 μg/mL 的致病疫霉孢子囊悬浮液10 mL;同样，在60 mm培养皿中先加入9 mL浓度为1×105个/mL的致病疫霉游动孢子悬浮液，再分别加入1 mL浓度为320、160、80、40、20、10 μg/mL的含离子钛溶液，以不含离子钛的无菌水为对照，分别获得离子钛浓度为32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游动孢子悬浮液10 mL。

1.2.4 离子钛对生物学特性的影响测定 致病疫霉菌丝生长：在含离子钛16、8、4、2、1 μg/mL和不含离子钛的黑麦蔗糖琼脂培养基平板中央接种直径为5 mm致病疫霉菌饼后，经2 500 lx光照2 h，置于 18 ℃，黑暗条件下，每个处理重复3次，7 d后采用十字交叉法统计菌落直径。平板菌落直径用平均值±标准偏差表示，抑菌率=（对照组平均菌落生长直径-处理组平均菌落生长直径）/对照组平均菌落生长直径×100%，以t检验分析组间差异，P<0.05 视为差异显著，P<0.01视为差异极显著。

致病疫霉游动孢子释放：将含离子钛 16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉孢子囊悬浮液经2 500 lx光照2 h后，置于6 ℃、黑暗条件下培养3 h，统计每20个致病疫霉孢子囊中游动孢子的释放数，每个处理重复3次。

致病疫霉游动孢子萌发：将含离子钛32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游动孢子悬浮液经 2 500 lx 光照2 h后，置于18 ℃、黑暗条件下培养12 h，统计每20个游动孢子的萌发数，每个處理重复3次。

致病疫霉致病力：将含离子钛 32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游动孢子悬浮液接种于马铃薯组培苗离体叶片，每张叶片接种5 μL，每个处理15张叶片，重复3次，在18 ℃、光—暗条件为16 h—8 h 条件下培养5 d后统计发病叶片数。

1.3 数据统计

利用Microsoft Excel 2007进行数据处理和图表制作，利用DPS v7.05进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 离子钛对致病疫霉菌丝生长的抑制作用

由表1可知，各浓度钛离子对致病疫霉菌丝生长的平均抑制率存在显著差异，其中16 μg/mL 离子钛处理对致病疫霉菌丝生长的平均抑制率最高，为95.77%。离子钛对不同省（市）致病疫霉的半最大效应浓度（EC50）差异较大，最高为15.007 3 μg/mL，最低为2396 8 μg/mL，平均EC50為5.3 321 μg/mL（表2）。

2.2 离子钛对致病疫霉游动孢子释放的影响

由图1可知，致病疫霉孢子囊在钛离子浓度为0、1、2、4、8、16 μg/mL时的游动孢子平均释放率分别为74.05%、65.95%、62.14%、51.19%、3333%、0.71%。差异性分析结果表明，1 μg/mL 钛离子试验组的游动孢子释放率与对照组（0 μg/mL）之间存在显著性差异（P<0.05），而钛离子浓度为2、4、8、16 μg/mL的游动孢子平均释放率与对照组之间存在极显著差异（P<0.01），其中，16 μg/mL的离子钛对致病疫霉孢子囊游动孢子释放有明显的抑制作用，平均抑制率为99.04%。

2.3 离子钛对致病疫霉游动孢子萌发的影响

由图2可知，致病疫霉游动孢子在钛离子浓度为0、1、2、4、8、16、32 μg/mL时的平均萌发率分别为91.67%、86.67%、71.67%、51.67%、36.67%、25.00%、6.67%。差异分析结果表明，含2、4、8、16、32 μg/mL 钛离子的游动孢子平均萌发率与对照组（0 μg/mL）之间存在极显著性差异（P<0.01），游动孢子萌发率随钛离子浓度的增加而下降，说明离子钛对致病疫霉游动孢子萌发有一定的抑制作用，其中32 μg/mL离子钛处理的平均抑制率最高，为9272%（图2）。

2.4 离子钛对致病疫霉致病力的影响

由图3可知，致病疫霉游动孢子在钛离子浓度为0、1、2、4、8、16、32 μg/mL时侵染马铃薯叶片，叶片平均发病率分别为100.00%、100.00%、10000%、100.00%、97.78%、84.44%、8.89%。差异性分析结果表明，试验组16、32 μg/mL 离子钛处理的叶片发病率与对照组（0 μg/mL）之间存在极显著性差异（P<0.01），对致病疫霉致病力的平均抑制率分别为15.56%、91.11%。

3 结论与讨论

我国作为全球第一大马铃薯生产国，为保证粮食安全，我国启动马铃薯主粮化战略，马铃薯成为继水稻、小麦、玉米之后的第四大主粮。而马铃薯晚疫病作为危害马铃薯生产的重要病害，每年造成数十亿美元的损失，其防治措施主要是喷施化学农药[6-9]。粮食安全和生态保护上升为国家战略，针对病虫害的绿色防控技术应用的呼声愈发高涨，结合农业供给侧改革，开发和使用高效低毒低残留药剂势在必行。离子钛利用钛具有外层电子活跃、对光敏感且发生化合价跳跃的特性，在促进植物养分的吸收和运转、提高植物体内多种酶的活性、增加叶片中叶绿素的含量、提高作物产量和品质[10-11]的同时，还具有提高植物抗逆性[12]和抑制细菌生长[5]等方面的作用，有望成为环境友好型农药。

致病疫霉是寄生性极强的兼性寄生菌，主要以游动孢子形成的休止孢产生芽管，自气孔或表皮直接侵入马铃薯块茎和叶片。本研究中离子钛对致病疫霉菌丝生长、孢子囊释放游动孢子、游动孢子萌发和致病力具有一定的抑制作用，其中32 μg/mL的离子钛处理对游动孢子萌发和致病力具有较强的抑制作用，而16 μg/mL的离子钛处理对致病疫霉菌丝生长和孢子囊释放游动孢子具有较强的抑制作用，但对致病疫霉致病力的平均抑制率较低，仅为1556%，这与致病疫霉致病力强有关，即使游动孢子浓度为1个/μL，仍能成功侵染叶片。同时，经400倍光学显微镜观察，未发现32 μg/mL的离子钛处理对菌丝生长端、孢子囊和游动孢子的形态产生明显影响。

目前，对离子钛的抑菌机制尚未见报道，但研究表明与离子钛相关的TiO2对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌及单细胞藻类均具有良好的杀灭效果[13]，推测离子钛主要是通过破坏细胞壁和细胞膜的完整性、干扰代谢途径、抑制蛋白质和核酸的合成等方面体现抑菌作用[5]。钛作为一个变价元素，在太阳光的作用下，其化合价可在四价和三价间反复变化，使钛具有较强的氧化还原能力，参与植物光合作用、生物固氮等重要生化过程的电子传递[7]。此外，离子钛对环境和生物友好，探讨离子钛对致病疫霉生物活性的影响，为进一步研究其抑菌机制和环境友好型药剂的开发提供理论依据。

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