基于网络药理学探讨补阳还五汤防治血栓形成的作用机制

冯月男 孙思邈 张玉昆

[摘要] 目的 运用网络药理学方法探寻补阳还五汤防治血栓形成的活性成分、靶点及信号通路。 方法 运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）检索药物，结合生物利用度和类药性两个药动学参数筛选补阳还五汤的活性成分及对应作用靶点;运用Genecard和OMIM数据库以血栓形成（thrombosis）为关键词找寻疾病相关靶基因，将药物与疾病靶基因取交集，并用Uniprot数据库进行靶点名称校正，利用Cytoscape软件构建化合物-靶点-疾病网络。将所得药物-疾病靶基因输入STRING在线数据库绘制PPI网络图，得出核心基因，进行GO及KEGG通路富集分析。 结果 补阳还五汤有61个有效活性成分，药物-疾病交集基因63个，参与作用的生物过程69个，作用通路有115个，主要参与调控肿瘤坏死因子（TNF）、PI3K-AKt、白细胞介素（IL）-17、NF-κB信号通路。 结论 补阳还五汤可通过调节多个基因调控多个信号通路治疗血栓性疾病，体现了中药复方多成分、多靶点、多通路的特点。

[关键词] 补阳还五汤;血栓形成;网络药理学;靶点;信号通路

[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（b）-0017-05

[Abstract] Objective To explore the active components， targets and signal pathways of Buyang Huanwu Decoction in preventing thrombosis by using network pharmacology method. Methods The traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform （TCMSP） were used to retrieve drugs， and the active ingredients and corresponding targets of Buyang Huanwu Decoction were selected by combining the two pharmacokinetic parameters of bioavailability and drug-like properties. Genecard and OMIM database were used to find disease-related target genes with the keywords of thrombosis. Drug and disease target genes were intersected， target names were corrected using Uniprot database， and compound-target-disease network was constructed by Cytoscape software. The obtained drug-disease target genes were input into STRING online database to draw PPI network diagram， and the core genes were obtained， and GO and KEGG pathway enrichment analysis were performed. Results Buyang Huanwu Decoction had 61 effective active components， 63 drug-disease intersection genes， 69 biological processes involved and 115 signaling pathways， which were mainly involved in the regulation of tumor necrosis factor （TNF）， PI3K-Akt， interleukin （IL）-17 and NF-κB signaling pathways. Conclusion Buyang Huanwu Decoction can regulate multiple genes to regulate multiple signaling pathways to treat thrombotic diseases， reflecting the characteristics of multiple ingredients， multiple targets and multiple pathways of traditional Chinese medicine compound.

[Key words] Buyang Huanwu Decoction; Thrombosis; Network pharmacology; Target; Signaling pathways

根據全球疾病负担（the global burden of disease， GBD）研究结果显示，脑卒中是全球第二大致死原因[1]，其中缺血性卒中占全部脑卒中的比例为50%～70%。血栓形成是引起缺血性疾病的主要原因，因此血栓的防治在这些疾病的治疗过程中显得尤为重要。中药方剂对于血栓疾病的预防及治疗有着重要的作用，中药方剂由多味药组成，其疗效是配伍后的有效成分共同发挥的作用。方剂的多个有效成分决定了其作用靶点的多样性，使得每个复方对应病症都有着一个复杂但却独特的网络，运用这个网络来分析复方的作用机制或者配伍规律使药物和疾病之间的复杂关系更加明了化的方法称为网络药理学[3-5]。

补阳还五汤是治疗气虚血瘀证的经典名方，具有补气养血、活血通络之功效[6]。现代国内外学者对于补阳还五汤对血栓形成的研究已经从宏观到达了分子生物学层次，但对于补阳还五汤具体的作用靶点，参与的生物过程，调控多少条通路的系统研究还不太多。本文以补阳还五汤为探针，以其对血栓形成的有效成分-靶点-通路为研究对象深入探讨补阳还五汤干预血栓形成的作用机制。

1 材料与方法

1.1 补阳还五汤化学成分的收集与靶标基因预测

以补阳还五汤中黄芪、归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花作为关键词检索中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）得出本方所含化合物及靶基因，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-like，DL）≥0.18为筛选条件，通过Uniprot将中药对应靶基因进行标准化匹配。

1.2 血栓形成疾病相关基因收集

将关键词thrombosis录入Genecard和OMIM数据库收集合并疾病相关基因。

1.3 构建化合物-靶点-疾病网络

利用Cytoscape软件中的Merge插件将药物作用靶点与血栓形成相关基因取交集，构建化合物-靶点-疾病网络。

1.4 蛋白互作网络（PPI）构建

将“1.3”取得的交集基因录入在线STRING平台，构建靶点之间的PPI，绘制PPI网络图，利用插件CentiScape得出核心基因，并以PPI中出现次数最多的前30个基因为纵坐标，以在网络中出现的次数为横坐标，绘制柱形图。

1.5 GO生物功能富集分析與KEGG信号通路富集分析

利用DAVID在线数据库将补阳还五汤作用血栓形成的靶基因进行GO分析与KEGG通路富集分析，利用Omicshare平台转换成气泡图。

2 结果

2.1 化合物-靶点-疾病网络构建。

补阳还五汤775个化合物中符合筛选条件的化学成分共131个，合并药味间共有成分，药物有效活性成分共61个。七味药物共5320个对应靶点，疾病相关基因共2423种，共得到63个疾病与药物的交集基因。见图1。

2.2 PPI网络的构建及核心基因筛选

PPI网络包含63个节点，544条相互作用关系（连线）。见图2。将PPI结果以TSV形式导出，再导入Cytoscape软件，根据“度”“度介中心度”和“接近中心度”分析网络拓扑结构，筛选出核心靶点网络。其中排在前30位的核心基因结果见图3。

2.3 GO生物功能分析和KEGG通路富集分析

经分析发现共参与生物学过程69个，其中类固醇结合、细胞黏附分子结合、核受体活性等生物过程与血栓形成有直接关系，图4（封三）为评分最高的前20个。共获得了115条信号通路，其中肿瘤坏死因子（TNF）、PI3K-AKt、白细胞介素（IL）-17、核因子（NF）-κB信号通路与血栓形成联系紧密。见图5（封三）。选取与本研究相关且评分最高的TNF信号通路为例，展示以补阳还五汤为探针对血栓形成影响的TNF信号通路作用图。见图6。

3 讨论

血栓形成是引起心血管疾病的主要原因之一，而多数的炎症信号通路均通过组织因子（TF）的表达、内皮细胞和血小板活化以及聚集加剧血栓形成和发展[7]。本文通过网络药理学分析得出的通路中TNF、PI3K-Akt、IL-17、NF-κB信号通路均属于炎症信号通路，且与血栓形成有着密切关系。

TNF信号通路：TNF-α是由血管内皮细胞等分泌的炎症因子。TNF-α通过对血管内皮细胞刺激使其分泌IL-1，同时诱导内皮细胞中血小板活化因子（PAF）的生成，增强血小板的促凝功能，与血栓形成呈正相关[8-9]。TNF-α还可促进TF的产生与表达，抑制血栓调节蛋白（TM）的表达，激活凝血途径，下调机体抗凝功能[10]。TNF家族可使NF-κB通路活化，NF-κB的高度活化能紊乱微血管的纤溶系统，从而导致血栓形成[11-12]。同时，NF-κB参与重要免疫受体的调节，NF-κB的过度活化又可引起TNF-α、IL-1等致炎症因子的大量合成和释放[13-14]，有利于血栓的形成。

PI3K-AKt信号通路：是诱导血小板内颗粒物释放、激活及黏附的重要信号通路[15]，PI3K激酶可使血小板颗粒分泌及活化[16]，而血小板活化是引起血栓形成的主要原因之一。PI3K家族中的PI3Kγ和PI3Kβ的双重激活使TPO通过TXA2途径增强血小板功能，导致血管内凝血;PI3KC2α能保持血栓在血流中形态;PI3K vps34可通过影响氮氧化物的组装调节血小板活性[17-18]。PI3K-AKt的激活还可以使下游的IκBKA上调，从而激活NF-κB通路诱导多种靶基因参与调控血栓形成。因此研究PI3K-AKt通路对于研究心血管疾病与血栓生成的关系具有重要意义。

IL-17信号通路：IL-17家族是一类炎症因子，能够诱导内皮细胞和细胞间黏附因子的表达。IL-17A作用于血管和心脏细胞，可导致炎症、凝血和血栓形成[22]。IL-17能激活NF-κB通路，调节基因黏附分子和炎症相关因子VCAM-1、ICAM-1、IL-6等，其中VCAM-1黏附在受损的内皮细胞上可以诱导血小板活化和黏附[23]，IL-6可以诱导中性粒细胞产生大量的PAF，PAF在许多心血管疾病发病过程中扮演重要角色[24-26]。

通过网络药理学分析显示，补阳还五汤可能以NF-κB通路为核心，通过TNF、PI3K-AKt、IL-17信号通路对抗血栓形成，下一步我们将围绕着分析结果进行具体的实验验证。

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（收稿日期：2020-05-08）