miR-21 在原发性肝癌组织中的表达及对细胞生物学行为的影响

汪旭伟， 马沛

（河南省南阳市第一人民医院 普外一科， 河南 南阳473000）

microRNAs （miRNAs） 是一类在转录后与肿瘤的发生发展密切相关的小分子、 非编码 RNA［1］。 近年来 miR－21 被证实在直肠癌、 宫颈癌、 肝癌等癌症组织中呈异常表达， 但其具体调控机制尚未完全明确。 研究［2］表明， 我国每年肝癌患者新增超40 万例， 且发病率仍逐年上升， 故而进一步探寻肝癌组织中 miR－21 的调控机制意义重大。 目前已有研究［3］显示 miR－21 在肝癌组织中呈异常表达水平， 但针对其异常表达后对肝癌细胞的增殖、 转移等癌症组织的重要生物学特征仍鲜有报道。基于此， 本研究通过观察肝癌组织、 癌旁组织中miR－21 的表达水平， 并构建低表达、 高表达miR－21 肝癌细胞株， 以期探寻miR－21 对原发性肝癌细胞增殖、 转移和侵袭的调控机制，为后续临床病情判断和治疗方案制定提供参考， 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取 2014 年 7 月至 2019 年 3 月我院收治的原发性肝癌患者100 例， 分离其肝癌组织和癌旁组织， 取材后迅速将样本置于液氮中待测。

1.2 细胞株和主要试剂

1.2.1 试剂和仪器 Has-miR－21 inhibitor 和 Hsa－miR－21 mimics（Biomics Biotech）， 胰蛋白酶、 DMEM 培养液 （上海杰美基因医药科技有限公司）， 胎牛血清 （赛默飞旗下 Gibco）； RNA 提取试剂、 Lipo－2000 转染试剂盒 （赛默飞）， Takara 反转录试剂盒 （北京绿源伯德）， 低温离心机 （浙江三联环保科技股份有限公司）， 超低温冰箱 （广州傲雪）， UNIVERSAL 320／320R 冷冻离心机 （美国贝克曼）。

1.2.2 HepG2 细胞培养和传代 自事先保存样本的液氮中取出HepG2 细胞冻存管， 水浴融化后移至15 mL 离心管中， 随后离心分离上清液， 在5% CO2、 37 ℃含10%胎牛血清培养基中培养。 待细胞株生长密度为90%时进行传代， 首先将洗涤后的细胞经0.25%胰酶消化， 随后采用4 mL DMEM 培养基中断细胞消化， 并采用倒置显微镜下观察， 最后以50%的接种密度将细胞接种于 6 孔板， 并依据操作手册分别采用 Has-miR-21 inhibitor （ 100 nm／L） + Lipofectamine 2000， Hsa -miR -21 mimics （50 nm／L） + Lipofectamine 2000 进行转染。

1.3 细胞增殖检测采用MTT 法将增强组、 抑制组按每孔 1 ×103个分别接种于96 孔板中。 培养 7 d 后加入MTT 测定液10 μL， 37 ℃孵育 2 h， 随后采用酶标仪在 450 nm 波长处测定吸光度值， 并计算肝癌细胞株增殖情况。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0 统计学软件处理数据， 计量资料以表示， 行 t 检验， P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织与癌旁正常组织miR－21 及MAP2K3 表达水平比较qPCR 检测结果显示， 癌旁正常组织、 肝癌组织的miR-21表达量分别为 67.86 ± 0.59、 89.63 ± 4.42； 癌旁正常组织、 肝癌组织的 MAP2K3 表达量分别为 5853.61 ± 271.85、 1396.78 ±97.36； 组间数据比较差异有统计学意义 （P ＜0.05）。 见图 1。

图1 肝癌组织与癌旁正常组织miR－21 及MAP2K3 表达水平比较

2.2 miR－21 对肝癌HepG2 细胞株增殖的影响抑制组增殖细胞数为 265.73 ± 58.62， 低于增强组的 429.54± 69.35 （P ＜0.05）； 抑制组的迁移细胞数为 87.52 ± 19.31。 见图 2。

图2 miR－21 对肝癌HepG2 细胞株增殖、 迁移、 侵袭的影响

3 讨论

我国受公共卫生水平限制， 丙型肝炎病毒 （HCV） 和乙型肝炎病毒 （HBV） 感染风险显著高于西方国家。 长期 HBV 感染极易导致肝硬化， 进而显著提升肝癌发病风险。 研究［4-5］表明， 肝炎合并肝硬化和HBV 感染为肝癌发病的独立危险因素。既往肝癌诊断多采用甲胎蛋白 （AFP） 作为特异性标志物， 但在临床诊断中发现异常凝血酶原 （DCP） 和甲胎蛋白异质体（AFP-L3） 特异度和灵敏度均较差， 故而在肝癌发生发展中寻找更具特异度和灵敏度的血清标志物意义重大。

Lin-4 最早被发现于1993 年， 为最早被发现的microRNA，在随后的不断深入研究中发现miRNAs 的表达非常保守， 且仅在特定组织、 特定发育阶段表达， 故被誉为基因表达研究领域中的新里程碑。 迄今已有上百种miRNAs 被发现， 且已有部分miRNAs 被证实在癌细胞的增殖、 迁移、 侵袭中具有独特的调控作用， 其中miR-21 在胰腺癌、 食管癌、 肺癌中呈异常表达。Zhuang 等［6］发现在肝癌患者血清中 miR-21 呈异常水平表达，且结果显示AFP 和miRNA 组合的敏感性为87.0%， 这预示着miR-21 可作为肝癌诊断的高特异性血清标志物。 本实验结果显示， 肝癌组织miR-21 表达水平明显高于癌旁正常组织 （P ＜0.05）， 表明与正常组织相比， 原发性肝癌患者癌症组织中存在明显的miR-21 过表达现象。

既往实验多针对肝癌患者miR-21 是否过表达展开讨论，而miR-21 对肝癌细胞有关的生物学行为却鲜有报道。 在细胞增殖、 分化过程中MAPK 蛋白家族中的p38 信号途径尤为重要， 而MAP2K3 又与p38MAPK 信号通路激活存在密不可分的关系。 本实验分别转染了Has-miR-21 inhibitor 和Hsa-miR-21 mimics， 结果显示抑制组增殖细胞数为 265.73 ± 58.62， 显著低于增强组的 429.54 ± 69.35 （P ＜0.05）， 表明 miR-21 对肝癌细胞的生物学行为存在调控作用。 分析原因在于： 在肝癌HepG2细胞株中存在miR-21 可直接作用的靶点位 MAP2K33＇UTR，miR-21 可通过与 MAP2K33＇UTR 上仅8 bp 的预测位点抑制荧光素酶的表达。 此外本实验结果也显示， 肝癌组织中MAP2K3的表达水平明显低于癌旁正常组织 （P ＜0.05）， 表明作为在原发性肝癌中呈低表达的MAP2K3 基因可被视为新的抑癌基因，而通过调控miR-21 的表达对MAP2K3 存在的负向调节机制为临床肝癌治疗提供了新思路。

综上所述， 在原发性肝癌组织中miR-21 呈过表达， 可通过抑制miR-21 表达， 进而靶向调节MAP2K3 表达水平， 从而降低肝癌细胞的增殖、 迁移和侵袭。