碳纳米管/金用于孔雀石绿快速拉曼检测

侯 婷，蒋雨宁，杨海峰

（资源化学教育部重点实验室，上海师范大学化学系，上海200234）

0 引言

孔雀石绿（MG）是一种人工合成的三苯甲烷类化合物，有较强的的抗菌效力，被广泛用于水产品养殖，预防与治疗鱼类细菌、真菌和寄生虫感染，是治疗水霉病的特效药[1-3]。另一方面，MG在水源中残留性强，极易通过食物链被人体摄入，对生物体有潜在的致畸、致癌、致突变等毒副作用。2002年，我国将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，并在2005年制定了使用标准，规定水产品中MG及其代谢物无色孔雀石绿（LMG）的残留总限量不得超过1 μg/kg[4]。但是，由于其成本低，抗菌效果好，加之市场上暂无特效替代药品等因素，养殖户违规使用MG的情况屡禁不止，导致水产品以及环境水系受污染，威胁到人类健康。

通常，检测孔雀石绿的方法有高效液相色谱（HPLC）[5]，液 相 色 谱 质 谱/质 谱 联 用（LC-MS/MS）[6]，酶联免疫吸附法（ELISA）[7]等。但上述方法均需要复杂的前处理过程，所使用的仪器昂贵也不便携，对专业技术人员的操作要求高，无法实现现场快速检测。表面增强拉曼散射（SERS）技术有非破坏性、高灵敏度、高选择性、振动信息指纹识别能力和快速检测等特点，已在生物样品检测、食品安全和环境监测等领域有广阔的应用[8-9]。公认的SERS增强机制有化学增强（CM）和电磁场增强（EM）机制。局部表面等离子体共振（LSPR）产生主导EM机制，其增强因子可达到4到11个数量级[10]。SERS基质的尺寸，形状和组成会影响其表面电磁场分布，所以基底材料的优化制备是建立稳健的SERS分析方法至关重要的因素。

碳纳米管（CNT）有较大比表面积，可负载贵金属纳米粒子并防止其团聚，使得SERS热点均匀分布，是一种理想SERS基底载体[11]。目前，金属纳米粒子-碳纳米管复合材料的制备和在SERS检测中应用已被广泛研究[12-14]。该文通过优化氨基修饰碳纳米管（CNT-NH2）与金纳米粒子（Au NPs）的体积比，制备了碳纳米管/金（CNTAu）复合材料，以期获得最佳的SERS增强效果。基于CNT-Au对MG的富集作用，有利于MG分子进入SERS热点区域，可大大提高检测灵敏度。结合便携式小型拉曼仪器，可实现对痕量MG残留的现场快速灵敏检测，有很强的应用前景。

1 实验部分

1.1 化学试剂

多壁碳纳米管（CNT），浓硝酸，浓硫酸，二氯亚砜（SOCl2），乙二胺，甲苯，氯金酸，柠檬酸钠，结晶紫（CV），孔雀石绿（MG）购于国药试剂有限公司。所有试剂为分析纯，未经任何纯化。所有实验操作均使用去离子水。所用玻璃器皿先在王水中浸泡，再用去离子水彻底清洗。

1.2 实验仪器

利用扫描电子显微镜图（SEM）（型号：Hitachi S-4800）透射电子显微镜（TEM）（型号：JEOL JEM-2000 FX）对CNT-Au基底形貌进行观察。采用X射线光电子能谱（XPS；Axis 165,Kratos）分析复合纳米材料的化学元素组成。UV-7504 UVVis分光光度计(上海欣茂有限公司)收集所制备材料的紫外可见光谱。拉曼（Raman）谱图的测定是用Enwave公司便携式拉曼仪器测定，其激发光源是波长为785 nm的二极管激光器。

1.3 氨基修饰碳纳米管的合成

碳纳米管的氨基修饰参照文献的方法[15]。具体步骤为：将碳纳米管在浓硫酸与浓硝酸混合酸中超声30 min混合均匀，70℃加热回流3 h对碳纳米管进行酸化。将羧酸官能化后的碳纳米管冷却到室温，离心并用去离子水洗三次后置于80℃真空干燥箱内干燥24 h。再将200 mg酸化后的碳纳米管与50 mL SOCl2混合，并在70℃下加热回流12 h对其进行氯化处理后，利用旋转蒸发仪在30℃的条件下除去残留的SOCl2。最后将所得固体分散到10 mL甲苯中，在氮气保护下，逐滴滴加到10 mL浓度为5 mg/mL乙二胺的甲苯溶液中于70℃反应回流24 h。最后将产物离心并用乙醇洗三次置于50℃真空干燥箱内干燥24 h后，得到黑色的CNT-NH2固体粉末。

1.4 金纳米粒子的合成

金纳米粒子的合成参照了Frens方法[16]，量取0.25 mL 1%氯金酸加入到100 mL超纯水中，加热至沸腾，待沸腾15 min后，快速加入1.5 mL 1%柠檬酸钠溶液，待溶液变为酒红色后开始计时，保持沸腾状态30 min。最后将合成好的金纳米溶胶冷却到室温，密封避光4℃保存。

1.5 碳纳米管/金纳米粒子复合材料（CNT-Au）的合成

配置1 mg/mL的CNT-NH2溶液，并将其与金纳米溶胶混合，两者体积比例分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10。将混合液搅拌5 min，使CNTNH2与金溶胶充分混合。静置20 min后，用离心机以2000转/分的转速将混合液离心，去除未与氨基修饰碳纳米管结合的金纳米粒子。

1.6 孔雀石绿的SERS检测

将5μL不同浓度的孔雀石绿溶液与5μL SERS基底CNT-Au（2 mg/mL）均匀混合，在8.0×8.0 cm2的铝箔纸上滴样。用手提便携式拉曼检测，每个拉曼谱图累积次数为3次，扫描时间为3 s。

图1为CNT-Au材料的合成过程。

图1 CNT-Au材料的合成过程Fig.1 Schematic illustration for the preparation of CNT-Au

2 结果与讨论

2.1 CNT-Au复合材料的表征

图2 A和2B为CNT-Au的透射电子显微镜（TEM）图，从图中可以看到修饰在碳纳米管上Au NPs的粒径约为10~30 nm。图2 C和2D为CNT-Au扫描电子显微镜（SEM）图。如图所示，基于氨基与Au NPs的相互作用，合成的材料中含有较多且密集的金纳米粒子，形成了更多的“热点”使该基底具有更好的SERS增强效果。

图2 (A,B)CNT-Au TEM图，(C,D)CNT-Au SEM图Fig.2 TEM(A,B)and SEM(C,D)images of CNT-Au

为进一步确定CNT-Au的组成成分，对XPS结果进行分析以确定纳米材料的元素组成。如图3所示，291.2 eV和284.7 eV对应于C 1s轨道结合能[17]，81.9 eV和87.8 eV对应于Au 4f轨道结合能[18]，399.8 eV对应于N 1s轨道结合能[19]，表明C、Au、N三种元素的存在，进一步验证了CNT-Au纳米材料的成功合成。

图3 CNT-Au纳米材料XPS表征Fig.3 XPS survey spectrum of CNT-Au

2.2 CNT-Au复合材料合成优化

以10-6mol/L CV为拉曼探针，研究了不同CNT和金体积比制备的CNT-Au基底的SERS增强效果。由图4可知，拉曼强度随着金用量的增加而增加，当体积比为1∶3时，在1169 cm-1处的CV特征峰强度达到最大值。继续加入金溶胶，发生了一定程度的团聚反而导致“热点”消失，拉曼强度出现明显下降。用紫外-可见光谱分析探究不同比例制备的CNT-Au基底SERS增强效果不同的原因。如图4B所示，随着Au NPs数量的增加，CNT-Au的吸收峰出现红移，峰变宽，当CNT-NH2与Au NPs的量的比值为1∶3时，在530 nm出现了一个较为明显的吸收峰，其吸收值远大于体积比为1∶5和1∶10时所制备的CNT-Au，这可能是Au NPs发生团聚沉淀引起的。拉曼实验中，体积比1:3时制得的CNT-Au能产生最佳的拉曼增强信号，可用于后续孔雀石绿检测。

图4 (A)以不同体积比CNT：Au制备的CNT-Au为基底检测10-6 mol/L CV的SERS谱图；(B)Au NPs(a)以及不同体积比CNT：Au(b)1∶3,(c)1∶5,(d)1∶10制备CNT-Au的紫外-可见吸收光谱Fig.4 (A)SERS spectra of CNT-Au substrates prepared with different volume ratio in the presence of 10-6 mol/L CV;(B)UV–vis absorption spectra of AuNPs(a)and CNT-Au prepared with different volume ratio(b)1∶3,(c)1∶5,(d)1∶10

2.3 CNT-Au复合材料作为SERS基底检测孔雀石绿

以柠檬酸钠为还原剂合成的Au NPs带负电性，而MG是一种带正电性的分子，所以用柠檬酸钠合成的Au NPs对孔雀石绿有静电吸引力作用，可达到富集的目的[20]。同时，碳纳米管作为一种卷曲状态的石墨烯材料，与MG之间存在π-π共轭作用力，进一步增强了该基底对MG的富集作用。此外，通过调节不同比例的CNT-NH2与Au NPs的量，控制了Au NPs之间的“热点”距离，将Au NPs之间的距离调节到最佳值，使CNT-Au的SERS增强效果达到最优值。化学增强与SPR增强相互协同作用，使该基底可实现对痕量MG的快速、灵敏检测。图5显示了在最佳条件下以CNT-Au为SERS基底检测不同浓度MG的拉曼光谱图。如图5A所示，1165 cm-1处的SERS峰强随着MG浓度的升高而增强，图5B显示了1165 cm-1峰的强度变化与MG浓度在1 ppm到0.1 ppb范围内之间的良好线性关系，相关系数R2=0.9952。以CNT-Au作为SERS基底对MG的检测最低限为0.01 ppb（如图5A内插图所示）。

图5 (A)CNT-Au检测不同浓度MG的SERS谱图（内插图为10-7 g/L MG的SERS放大图）(B)MG在1165 cm-1处特征峰SERS强度与MG浓度之间的线性关系Fig.5 (A)CNT-Au-based SERS spectra of MG with different concentrations(inset is the amplified SERS spectrum of 10-7 g/L MG);(B)The calibration curve based on Raman intensity at 1165 cm-1

2.4 实际水样中MG的回收率测定

将MG加入到河水中配置成浓度为10μg/L的实际样品，经膜过滤简单处理后，用CNT-Au材料对处理后的实际样品进行SERS检测，以验证该基底在实际检测中的实用性。从表1可以看出，不同水样中MG的回收率范围介于96%至112%之间，表明该SERS传感器的准确与可靠性。以上结果表明，基于CNT-Au体系的SERS方法可实现对MG的灵敏快速检测，是一种简单可靠的监测水样中MG含量的分析方案。

表1 实际水样中MG的测定结果Tab.1 Determination results of MG in actual water samples

3 结论

将碳纳米管氨基功化后，组装金溶胶，成功制得有强SERS效应的碳纳米管/金复合材料。通过TEM、SEM、UV等表征手段，发现Au NPs在碳纳米管壁上分布均匀，形成很多SERS热点。基于MG与碳纳米管以及Au NPs之间的相互作用，使MG分子富集并固定在CNT-Au表面热点区域，大大提高了对MG的检测灵敏度，最低检出限可达0.01 ppb。采用便携式小型拉曼仪器，有望实现现场快速检测MG在河水中的残留。