基于共反应促进剂提高电致化学发光分析灵敏度的最新研究进展

孙曼菲，柴雅琴，袁 若

（西南大学化学化工学院，重庆400715）

0 前言

电致化学发光（ECL）是一种由电化学反应和化学发光反应联合同时发生在电极表面或附近的发光过程[1-2]。基于电化学和光谱学的巧妙组合，ECL显示出了与其他光学方法相比更大的潜能。因此，ECL技术不仅具有传统化学发光灵敏度高和动态范围广的优势，同时还具备了电化学方法稳定、简易、可控等优点。与荧光相比，ECL不需要外部光源，不仅仪器设备简单，而且避免了发光杂质和散射光产生的背景响应，所以具有高灵敏度。并且，由于ECL发光材料靠近电极表面，因此ECL对发光的位置有较好的控制。最后，ECL能在操作中更精确地控制时间，进一步提高了它们的简易性和重现性[3]。因此，ECL作为一种优秀的分析技术，目前已被广泛应用于与分析化学相关的领域，例如医学诊断、食品和水中的危险化学品检测和生物试剂检测等[4]。

对ECL的研究可以追溯到20世纪60年代，当时Hercules和Bard首次提出了ECL技术理论和具体研究[5-6]，并报告了他们的开创性研究工作。此后，在揭示ECL机理和设计ECL传感器方面进行了大量的探索。到目前为止，ECL过程中已经证实了两种主要的发光途径：湮灭途径和共反应物途径[7]。对于共反应物途径，ECL过程是在系统中有ECL发射器和共反应物存在的情况下，通过单一方向的电位扫描来完成的。通过电化学氧化或还原，共反应物被分解成活性中间体与ECL发光团发生反应，在此过程中，发光团转化为发光体。与湮没途径相比，共反应物途径具有更好的自由基离子稳定性和更强的ECL发射能力，在构建灵敏可靠的ECL生物传感器方面具有更大的应用前景[8]。

为了进一步提高共反应物和ECL发光体的反应效率，课题组基于共反应物途径引入了共反应物促进剂，进一步推动了ECL发光机理的深入研究[9]。共反应促进剂是通过催化共反应物分解成活性自由基，进而增强ECL发光体的发射。值得注意的是，共反应促进剂的发展主要集中在纳米材料的研究上。然而，纳米材料基共反应促进剂的ECL性能受到其不同尺寸、形状和化学成分的显著影响，这使得ECL共反应促进剂的结构-性能相关性难以揭示。因此，设计具有明确活性中心的共反应促进剂，简化模型结构的建立和相应的理论计算，从而深入了解其基本机理是非常需要的。

虽然前人已经报道了几篇关于ECL传感器研究的综述，但它们主要集中在新型发光材料和ECL传感策略上[10-11]。很少有人从新型共反应促进剂的设计和应用的角度对ECL传感器的发展进行评述。该文主要基于共反应促进剂综述了近年来用于灵敏ECL传感的共反应加速器的研究进展。此外，简要讨论了基本机制和常见的传感策略，以促进理解催化的本质。最后，总结了高性能ECL传感器共反应加速器的发展前景和面临的挑战。

1 电致化学发光机制

1.1 湮灭途径

离子湮灭反应是通过施加一定电压后，ECL发光体经过电化学氧化或还原产生自由基阳/阴离子，然后产生的自由基离子相互反应产生激发态物质弛豫发射光的过程[12]。其中，湮灭过程中产生的自由基阳离子和自由基阴离子可以来自相同分子也可以来自不同分子。离子湮灭过程一般在有机溶剂中进行，因为需要阳离子和阴离子保持相对稳定性。湮灭过程的优势是它仅需ECL发光体、溶剂和支持电解质就能产生光。但是，由于生物分析运用主要在水溶液中进行，有机溶剂中的ECL无法应用于生物传感。其中，离子湮灭反应中的一个典型的例子是9,10-二苯蒽（9,10-diphenylanthracene,DPA），它的ECL发光机理如下[6]：

1.2 共反应物途径

在ECL共反应物途径中，主要通过在含有ECL发光体和共反应物溶液中的电极上进行循环电位扫描来产生ECL现象[13]。首先，发光体和共反应物同时被电化学氧化/还原，之后被氧化/还原的共反应物产生中间体通过分解生成强还原/氧化物质与被氧化/还原的发光体发生化学反应，产生发光物质的激发态，通过辐射跃迁发光。在ECL生物传感的共反应物途径中，发光体主要包括无机络合物、有机化合物和纳米材料等，而共反应物主要有阴极共反应物过硫酸根（S2O82-）和阳极共反应物三丙胺（TPA），三乙醇胺（TEA），过氧化氢（H2O2）等[14]。因此，使用共反应物方法的主要优点是克服了湮灭方式不能在水溶液中反应的缺陷，开辟了广泛的生物分析方法，同时加入共反应物可以实现更高的ECL发射。以g-C3N4/TPA为例，简要描述了共反应物型的ECL过程如下[15]：

1.3 共反应物促进途径

为了进一步提高ECL的强度，袁若小组报道了共反应促进剂，它能与共反应试剂相互作用，显著提高发光体和共反应物的ECL反应速率。在共反应促进剂的催化下，共反应物更容易分解成活性自由基，放大发光体的ECL发射，从而提高了ECL传感器的灵敏度和稳定性[16]。自从马等人首次提出以氨基脲作为共反应物来促进CdTe QDs/S2O82-体系的ECL反应速率，增强了ECL信号。近年来，已逐渐开发出各种不同种类的共反应促进剂（比如纳米材料，单原子材料，有机小分子等）用于不同的ECL共反应物体系（比如S2O82-，溶解氧，H2O2）[17]。 其中，以氨基脲（Sem）作为共反应促进剂在CdTe QDs/S2O82-体系中的ECL促进机理如下图1所示：

图1 氨基脲为共反应促进剂的ECL机理示意图[9]Fig.1 Schematic diagram of ECL mechanism of semicarbazide as co-reaction accelerator[9]

2 共反应促进剂在ECL传感器中的应用

2.1 过硫酸根为共反应试剂的ECL体系

过硫酸根（S2O82-）是钌配合物、量子点和金属纳米簇等多种发光体应用最广泛的阴极ECL共反应物。据报道，以S2O82-作为共反应物可能的ECL机制如下：S2O82-最初通过电化学反应生产SO4·-氧化中间体，它可以与ECL发光体（Emitters，E）反应注入电子占据分子轨道生成激发态的发光体（Emitters*，E*）。当激发态的发光体（E*）衰减回基态时产生ECL发射[18]：

因此，ECL的强度与氧化中间体的数量密切相关。发光过程中产生的SO4·-量越多，ECL响应就越强。通过研究，提高SO4·-产量的可行途径有两种：一种是提高S2O82-浓度，另一种是利用共反应促进剂加速S2O82-的电化学还原。然而，由于S2O82-的溶解度有限，并且S2O82-的浓度与SO4·-的量呈非绝对线性关系，仅仅提高S2O82-的浓度对ECL强度的增强作用有限[19]。因此，在ECL体系中引入共反应促进剂可以通过加速S2O82-的还原来促进SO4·-氧化中间体的生成，从而增加发光体的激发态，以此来放大ECL信号。自从马等人[9]首次报道了以氨基脲为共反应促进剂的ECL/S2O82-阴极体系以来，人们陆续开发出各种纳米材料包括金属纳米簇（如金簇，银簇等）[20-21]，金属氧化物（Cu2O，TiO2和Fe3O4-CeO2）[22-24]以及有机纳 米 材 料（Ru@MOF，IRMOF-3，Ag+@UIO-66-NH2）[25-27]等材料作为高效共反应促进剂来促进ECL发射进而增强S2O82-的ECL体系的发光效率。

袁若课题组廖等人[28]运用TiO2作为共反应促进剂构建了超灵敏的ECL生物传感器，并通过电化学反应原位生成的铜纳米团簇（Cu NCs）作为ECL发光体用于检测microRNA（如图2所示）。在该传感界面中引入的TiO2纳米材料，不仅可以作为ECL共反应试剂促进了共反应物S2O82-的还原，并显著提高了Cu NCs的ECL效率，同时还可以作为稳定Cu NCs的固定基质。由此可见，共反应促进剂的开发和应用不断拓宽了ECL分析领域的发展。

图2 基于TiO2为共反应促进剂构建ECL生物传感器[28]Fig.2 Schematic diagrams shown the establishment process of biosensor for the ultrasensitive determination of miRNA-21[28]

近年来，周莹等[24]还发现Fe3O4-CeO2纳米复合材料其具有氧化还原对Ce3+/Ce4+的可逆和快速切换，对S2O82-的还原具有增强的催化活性（如图3所示）。他们将其作为共反应促进剂，可以显著促进Ag NCs/S2O82-体系的ECL发射。因此，进一步不断开发新型纳米材料用于促进阴极S2O82-/ECL体系十分的重要。

图3 ECL生物传感器制造原理图[24]Fig.3 Schematic diagrams showing fabrication of the ECL biosensor[24]

2.2 过氧化氢为共反应试剂的ECL体系

以S2O82-为共反应物的ECL体系通常需要电化学检测电位大于-1.5 V才能获得足够强的ECL强度，这可能会引入更多的干扰或使电极损坏。相比之下，以H2O2为共反应物的ECL仅需要较低的激发电位就能获得较高的ECL效率。H2O2可以产生OH·和O2·-等氧相关的自由基，并作为共反应物用于鲁米诺及其衍生物等发光体增强ECL发射。辣根过氧化物酶（HRP）因其对H2O2分解具有优异的催化作用而被广泛用于提高鲁米诺/H2O2体系的ECL反应[29]。但HRP仍具有成本高、稳定性差、易变性等缺点[30]。目前因纳米材料具有优良的催化性能，克服了HRP的缺点，是H2O2共反应物ECL的良好替代共反应促进剂[31]。以咪唑基沸石骨架（ZIF-67）[32]、MIL-53(Fe)-NH2[33]、Co-MOFs[34]、铁蛋白（Ft）[35]、MoS2NF[36]、CuS多孔纳米球（CuS PNSs）[29]、CoFe2O4[37]、V2O5纳米球[38]等一系列具有加速H2O2分解作用的MOFs作为H2O2/ECL体系的共反应促进剂。

MOFs因其具有良好的催化性能和较大的比表面积，是H2O2共反应物ECL的有效共反应促进剂。Wang等[32]开发了一种提高鲁米诺/H2O2体系ECL效率的有效策略，即将Co2+基MOF、ZIF-67和鲁米诺包封的Ag NPs（鲁米诺-Ag NPs）组装在一起（如图4所示）。ZIF-67由于其有序的晶体结构、孔隙率和原子分散的Co2+，有利于H2O2的还原，产生更多的氧自由基（O2·-），导致ECL明显增强。ZIF-67具有较高的比表面积，为鲁米诺-Ag NPs的体系提供了良好的平台，避免了Ag NPs的团聚。ZIF-67和Ag NPs的联合使用使鲁米诺ECL显著增强（约115倍）。以鲁米诺-Ag NPs@ZIF-67为传感平台，采用稳定的无标记ECL免疫传感器实现了对急性心肌梗死标志物心肌肌钙蛋白I的超灵敏检测。

图4 基于Co-based MOF和AgNPs复合纳米材料的鲁米诺ECL增强示意图[32]Fig.4 Schematic illustration of the integration of Co-based MOF and AgNPs for the enhancement of luminol ECL[32]

2.3 溶解氧为共反应试剂的ECL体系

与H2O2在溶液中不稳定、对生物分子有害的缺陷相比，溶解氧在产生活性氧自由基（ROS）与发光团反应时具有相同的特性，且无毒，是ECL生物传感的理想替代共反应物[39]。此外，与强氧化共反应物S2O82-相比，溶解氧O2作为内源性共反应物具有反应条件温和、操作简单等优点，可用于CdTe、CdS、鲁米诺及其衍生物的ECL发射[40]。然而，溶解O2转化为ROS的效率有限，导致发光体/溶解O2体系的ECL发射微弱。因此，提高溶解氧的还原效率，产生更多ROS，显著提高O2参与系统ECL排放至关重要。目前各种纳米材料包括Au NFs、Pt NPs、Pt NFs以及Au-Ag-Pt、CeO2/SnS2等杂单结构被用于促进溶解O2生成更多的ROS中间体，从而大大提高ECL发射[41-43]。

一般来说，纳米材料可以作为ECL溶解O2体系的共反应促进剂，通常通过催化溶解O2生成H2O2进一步生成ROS来促进ECL发射。胡等人[44]报道，Au NFs材料具有独特的几何和空间效应，可以作为鲁米诺/O2系统ECL的有效共反应促进剂（如图5所示）。该体系以三（羟甲基）氨基甲烷为电子供体，在Au-NFs/ITO电极上高效催化H2O2还原。原位生成的H2O2可以更有效地产生各种ROS作为中间体，显著增强了鲁米诺的ECL信号。刘等人[42]用两种Pt NMs作为红荧烯微棒（RubMRs）/O2ECL体系的共反应促进剂：一种是在RubMRs上原位还原Pt NFs;另一种是标记在输出DNA上的Pt NPs（如图6所示）。在microRNA存在的情况下，目标物诱导的循环酶扩增产生大量S1/Pt NPs，取代了猝灭剂Fc-DNA，从而恢复了ECL信号。Pt NFs和Pt NPs均能促进溶解氧的还原，产生更多ROS（O2·-、OH·）与Rub·+相互作用。基于双共反应促进剂，一个超级信号的状态与一个更强的ECL信号，从而实现了显著提高灵敏度。

图5 （A）牛血清白蛋白/抗甲胎蛋白/AuNFs/ITO免疫传感器制备工艺示意图；（B）鲁米诺-O2系统可能的ECL机制[44]Fig.5 Schematic illustration of(A)fabrication process of BSA/anti-AFP/AuNFs/ITO immunosensor;(B)possible ECL mechanism of the luminol-O2 system[44]

图6 （A）PtNFs@RubMRs的制备流程（B）生物传感器的制备（C）RubMRs可能的反应机理示意图[42]Fig.6 Schematic illustration of(A)the synthesis of the PtNFs@RubMRs(B)fabrication of the biosensor,and(C)possible reaction mechanism of the RubMRs[42]

2.4 胺类物质为共反应试剂的ECL体系

胺类共反应物如TPA和三乙胺（TEA）的共反应促进剂的研究仍处于起步阶段。目前，只有少量的Cu2S纳米花[45]、Pd@CuO[46]、TiO2纳米针[47]等纳米材料可作为以胺类共反应物的ECL共反应促进剂。Cu2S纳米花可以显著提高Au NCs/TEA体系的ECL强度，其主要作用有两个：一是作为连接免疫分子的底物，二是作为共反应促进剂促进了阳离子自由基TEA·+的产生，从而可以氧化Au NCs，得到Au NCs·+的自由基阳离子。此外，TEA·+通过脱质子生成的TEA·可以使Au NCs还原成Au NCs－，Au NCs与Au NCs·+反应生成激发态Au NCs*。当Au NCs*衰变到基态时发生ECL发射。因此TEA·+的加入量决定了整个过程的ECL效率，而Cu2S可以促进更多中间TEA·+的生成，加速后续电极反应。Jian等[48]报道了AuPd NPs可以作为共反应促进剂（如图7所示），通过催化H2O2分解形成OH，进而与TPA反应产生更多的TPA，从而增强Ru@SiO2-Au/TPA的ECL，从而产生强ECL信号。

图7 （A）ECL检测区制造流程示意图及相应检测机制;(B)ECL体系的可能机制[48]Fig.7 Schematic diagram of the manufacture procedures for the ECL detection area and the corresponding detection mechanism;(B)The possible mechanism of ECL system[48]

3 研究前景和展望

共反应促进剂是通过促进生成更多的共反应物中间体来增强ECL的强度。由于其通用性、简易性和高灵敏度等优势，基于共反应试剂的ECL增强技术得到了人们的广泛关注。将共反应促进剂与ECL的固有优势相结合不仅有趣，而且由于提高了灵敏度，有可能进一步扩大ECL的应用范围。其中可应用于各种分析物，包括蛋白质生物标记物、microRNA、肿瘤细胞和重金属离子，都可以以超低的检测限进行检测，这在早期临床诊断、环境监测和食品安全方面很有前景。此外，基于纳米材料的共反应促进剂不仅可以作为促进ECL反应的共反应促进剂，而且还可以作为固载大量荧光团或抗体、适配体等生物分子的优良底物。

尽管共反应促进剂的研发和应用发展势头迅猛，但目前仍面临着巨大的挑战。第一，由于目前的机理主要是由以前的理论推导出来的需要深入探索基于共反应促进剂的ECL增强机制。未来还需要更多的实验探究来证明ECL机制与共反应促进剂类型之间的关系，以及通过ECL光谱等来验证所提机制的有效性。了解基于共反应促进剂增强ECL的机理有助于制备具有高ECL效率和低电势的新型共反应促进剂。第二，纳米材料共反应促进剂的制备技术应得到发展，使其尺寸和形状得到精确控制，从而在更广泛的生物分析领域得到应用。第三，目前基于共反应促进剂的ECL体系在细胞ECL成像中的应用仍处于起步阶段。基于共反应促进剂增强ECL具有显著的信号放大和准确的特异性识别，可以满足细胞ECL成像的需要。因此，未来的研究将集中于开发基于共反应促进剂的ECL成像，以满足研究和临床诊断的需求。综上所述，寻求具有理想结构和高效率的共反应促进剂的制备将是一个新的研究方向，基于共反应促进剂的ECL将在更多的现场和实时分析应用中得到应用。