基于网络药理学的二陈汤“异病同治”机制研究

丁珊珊，康 洁，黄益清，陈华琴，甘慧娟

（福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122）

二陈汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由半夏、陈皮、茯苓、甘草等药物组成，具有燥湿化痰、理气和中的功效。 作为中医经典的化痰方，二陈汤被广泛应用于临床，而且疗效较为显著。 包永生等［1］从文献、临床、药理等方面对二陈汤的研究进展进行了综述，表明二陈汤及其加减方主要用于呼吸系统、消化系统、内分泌系统、神经系统中某些病症痰证的治疗，如慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）等。 那么，二陈汤治疗不同疾病痰证的共同之处是什么？ 即二陈汤实现“异病同治”的物质基础是什么？ 随着系统生物学和多向药理学概念的深入，研究者们将网络药理学这一新的研究策略引入中医药学。 网络药理学通过构建中药成分、靶点与疾病之间的相互作用网络，对中药复方的作用机制进行研究，为从整体和系统地解决上述的问题提供了支撑。 因此，本文采用网络药理学的方法对二陈汤治疗不同疾病（COPD、NAFLD、PCOS）痰证的靶点作用网络进行生物信息学分析，探讨二陈汤“同病异治”的作用机制。

1 方 法

1.1 二陈汤成分收集与筛选 采用中药系统药理学平台［2］（TCMSP，http： ／ ／tcmspw.com ／tcmsp.php），在“herb name”检索框中分别以“半夏”“陈皮”“茯苓”“甘草”为检索词进行检索，收集这4 味药的化学成分信息。 对收集到的化学成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（druglikeness，DL）≥0.18 为筛选依据，筛选出二陈汤的活性成分。

1.2 二陈汤的作用靶点预测 采用TCMSP 数据库对筛选出的二陈汤的活性成分进行作用靶点预测，然后利用 UniProt 数据库（https： ／ ／www.uniprot.org／）中UniProtKB 检索功能对预测出的作用靶点进行逐一检索，并在检索结果中将物种限定为“human”，对所有预测到的二陈汤作用靶点进行一一对应的基因名称（official gene symbol）转换，获得二陈汤活性成分的作用靶点。

1.3 疾病的治疗靶点获取 分别以“chronic obstructive pulmonary disease”“non-alcoholic fatty liver disease”“polycystic ovary syndrome”为检索词，在TTD数据库（http：／ ／db.idrblab.net／ttd ／）、DrugBank 数据库（https：／ ／www.drugbank.ca／）、PharmGKB 数据库（https： ／ ／www.pharmgkb.org／）和 GeneCards 数据库（https： ／ ／www.genecards.org／）进行检索［3］，得到各个数据库的疾病治疗靶点，并去除重复项，分别获取COPD、NAFLD、PCOS 三种疾病的治疗靶点。 利用Venny 2.1.0 在线工具绘制韦恩图，将二陈汤的作用靶点与三种疾病的治疗靶点进行映射，获得二陈汤治疗这三种疾病的共同靶点。

1.4 网络的构建与分析 将二陈汤的单味药-成分信息和成分-靶点信息导入Cytoscape 软件（版本：3.2.1），分别绘制出二陈汤的单味药-成分网络和二陈汤成分-靶点网络，再利用Cytoscape 软件中的“Merge”功能，将单味药-成分网络和成分-靶点网络合并成二陈汤成分-靶点网络［4-5］。 将预测、筛选、映射到的二陈汤治疗COPD、NAFLD、PCOS 三种疾病的共同靶点导入到 String 数据库［6］（https： ／ ／stringdb.org／）“multiple proteins”检索框中，物种设置为“homo sapiens”，其他参数为默认设置，构建二陈汤-疾病共同靶点之间的相互作用网络（PPI 网络），并根据相关参数对PPI 网络进行分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 将构建好的PPI 网络中的核心节点，即共同靶点输入到David 数据平台［7］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／），选 择 类 型 为 “official gene symbol”，提交待分析基因列表，在Background中设置背景集为“homo sapiens”，选择“Functional Annotation Tool”分析工具，对共同靶点进行GO 和KEGG 富集分析。

2 结 果

2.1 二陈汤成分-靶点网络构建 通过TCMSP 数据库收集、筛选（OB≥30%、DL≥0.18）出二陈汤活性成分125 个，其中半夏13 个、陈皮 5 个、茯苓 15个、甘草92 个。 对以上活性成分进行靶点预测，剔除未找到作用靶点的活性成分，获得110 个化合物，其中半夏 12 个、陈皮 5 个、茯苓 6 个、甘草 87 个，见表1。 对所有预测到的作用靶点进行基因名转换后，保留唯一值，共获得到259 个预测靶点。 将筛选、转化后的二陈汤的单味药、活性成分及作用靶点导入 Cytoscape 软件（3.2.1 版本）构建二陈汤成分-靶点网络，见图1。 该网络包含371 个节点，其中绿色节点为单味药（4 个）、黄色节点为活性成分（110 个）、红色节点为作用靶点（259 个）。

2.2 疾病共同作用靶点获取 通过TTD、Drug-Bank、PharmGKB 和 GeneCards 数据 库检索得到 三种疾病治疗靶点，对各个数据库得到的治疗靶点取并集、去重复项后，COPD、NAFLD、PCOS 三种疾病分别获得 1 631 个、411 个、568 个治疗靶点，见表2。将二陈汤的作用靶点和三种疾病各自获得的治疗靶点分别输入Venny 2.1.0 在线工具绘制韦恩图，取交集，匹配得到二陈汤治疗COPD、NAFLD、PCOS的共同靶点24 个，包括脂联素（ADIPOQ）、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、小窝蛋白 1（CAV1）、CC 基序趋化因子 2（CCL2）、G1／S 特异性细胞周期蛋白D1（CCND1）、C-反应蛋白（CRP）、细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）、前表皮生长因子（EGF）、表皮生长因子受体（EGFR）、雌激素受体（ESR1）、白介素-10（IL-10）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、胰岛素（INS）、基质金属蛋白酶 2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP－9）、原癌基因蛋白（MYC）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶（PTEN）、前列腺素 G／H 合酶 2（PTGS2）、信号转导子和转录激活子 3（STAT3）、肿瘤坏死因子（TNF）、肿瘤抗原 p53（TP53）、血管内皮生长因子 A（VEGFA）。 见图2。

表1 二陈汤活性成分

2.3 相互作用网络构建与分析 将24 个二陈汤治疗COPD、NAFLD、PCOS 三种疾病的共同靶点输入到String 数据库，构建出共同靶点的PPI 网络模型，见图3。 该PPI 网络包含24 个节点（即共同作用靶点），246 条节点连接线（连接线表示两个节点之间存在相互作用，粗细代表相互作用关系的强弱）。 经计算分析，该网络平均度值为20.5（度值表示某一个节点与其他节点的连接数，度值越大，连接的节点数越多），其中 VEGFA、TP53、INS、IL-6、TNF、STAT3、PTGS2、MMP-9、MMP-2、CCL2、AKT1、ESR1、EGF、IL-10、PPARG 和 EGFR 等 16 个节点的度值高于平均度值，为该网络的关键靶点。

图1 二陈汤成分-靶点网络图

表2 三种疾病相关靶点数

2.4 GO 富集分析 通过David 数据平台对24 个共同靶点进行GO 富集分析，获得P＜0.05 的GO 条目 237 个，其中生物学过程（biological process，BP）条目 204 个、细胞学组分（cellular components，CC）条目 10 个、分子生物学功能（molecular function，MF）条目 23 个，展示 BP、CC 和 MF 分别富集到的基因数目排名前十的条目，见图4。 这24 个共同靶点主要参与RNA 聚合酶II 启动子转录调控、基因表达调控、细胞增殖与凋亡调控、转录调控、一氧化氮生物合成、蛋白质磷酸化调控、MAPK 和ERK 级联、炎症反应、信号转导、血管生成、葡萄糖稳态、衰老等生物学过程。

2.5 KEGG 信号通路富集分析 通过David 数据平台对24 个共同靶点进行KEGG 信号通路富集分析，根据P＜0.05 筛选到69 条信号通路，列出富集到的基因数目排名前20 条的信号通路，见表3。 24个共同靶点涉及到的信号通路类型主要有信号转导通路 （PI3K-AKT 信号、FoxO 信号、HIF-1 信号、TNF 信号、MAPK 信号、JAK-STAT 信号等）、癌症相关通路（膀胱癌、子宫内膜癌、小细胞肺癌等）、肝病相关通路（乙型肝炎、非酒精性脂肪肝）和胰岛素抵抗等。

图2 二陈汤-疾病共同作用靶点韦恩图

图3 共同作用靶点PPI 网络图

图4 共同靶点的GO 富集分析图

表3 KEGG 信号通路富集分析结果（前20）

3 讨 论

COPD 是以不可逆的气流受限为特征的慢性呼吸系统炎症性疾病，中医认为COPD 多以肺、脾、肾虚亏为本，以痰浊、血瘀阻络为标；NAFLD 则是与胰岛素抵抗密切相关的代谢性肝脏损伤，其基本病机是脾失健运、聚湿成痰、痰湿内蕴；而PCOS 是育龄期妇女多发且具有多因性、表现多态性的一组综合征，主要由脾肾两虚、肝气郁滞、痰湿内阻引起。二陈汤是经典的祛痰祖方，临床上经常被作为基础方用于治疗痰湿证［8-10］。中医提倡从整体出发，辨证论治，是临床上“异病同治”的依据。 中药复方对证治疗、多成分多靶点的协同作用，是实现“异病同治”的手段。 然而，因中药复方的多途径多效应特征，使其作用机制的研究受到挑战。 近年来，随着网络药理学的发展，将已知中药活性成分与疾病治疗靶点联系起来，能够从系统的角度探讨中药复方治疗疾病的机制［11-13］。 因此，本文采用网络药理学的方法对二陈汤异病同治COPD、NAFLD、PCOS 的内在机制进行分析。

本研究对二陈汤中四味中药的活性成分进行查询、筛选，获得110 个化合物，其中半夏12 个、陈皮5 个、茯苓 6 个、甘草 87 个，主要包含黄酮类化合物（黄芩苷、黄芩素、刺芒柄花素、光甘草素、光甘草定、柚皮素、橙皮素、川陈皮素、槲皮素、甘草苷、光甘草定等）、三萜类化合物（松苓新酸、16α-羟基松苓新酸、常春藤皂苷元、白桦脂酸等）、甾醇类化合物（豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、星鱼甾醇等），这些化合物已被报道具有抗癌、抗炎、抗细菌和抗氧化等生物学活性［5，14］。 这些活性成分共预测、筛选出259 个作用靶点，与查询、筛选出的 COPD（1 631 个）、NAFLD（411 个）、PCOS（568 个）的疾病治疗靶点匹配得到共同作用靶点24 个。

经 KEGG 信号通路分析富集到 PI3K-AKT、FoxO、HIF-1、TNF、MAPK、JAK-STAT、胰岛素抵抗和癌症相关等主要的信号通路。 这些信号通路在COPD、NAFLD、PCOS 治疗和机制研究中均有报道，且通路之间存在着交互作用。 PI3K-AKT 信号通路在调节细胞生长、代谢中具有关键作用，被PI3K 磷酸化的AKT 能够磷酸化很多底物分子，从而调控多种生物学效应。 研究表明通过调节PI3K／AKT 信号通路，可以减轻胰岛素抵抗，从而治疗和改善NAFLD［15-16］和 PCOS［17-18］，也能够减轻 COPD 的肺部和全身炎 症反应［19-20］。 FoxO 作为信号通路下游的关键调控因子，参与调节葡萄糖、甘油三酯和胆固醇稳态等一系列细胞功能，FoxO 的失调与 NAFLD 的发生有关［21］；PCOS 患者巨噬细胞中激活TLR4 炎症信号通路的FoxO-1 磷酸化水平受到 AKT 的抑制［22］；FoxO3 在肺炎症反应和抗氧化基因的调控中起关键作用，FoxO3 缺乏可导致 COPD 的发生［23］。 HIF-1 是低氧适应的关键决定因素，可以防止NAFLD 进展过程中肝脏过度的脂肪积聚［24］；HIF-1α 在 COPD 中 过表达，可能通过激活EGFR／PI3K／AKT 途径上调炎症因子的表达［25］；HIF-1α 信号 通路可能参 与了PCOS 患者子宫内膜功能障碍的分子机制［26］。MAPK信号通路跟炎症、凋亡、分化密切相关，研究显示调节MAPK-JNK／P38 信号通路可改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的NAFLD，减轻炎症反应［27］，激活PI3K／AKT 和抑制MAPK 途径降低大鼠模型系统的PCOS病理 和 胰岛 素抵抗［28］，p38MAPK 和 ERK1 ／2 可以通过增加 MAFbx／Atrogin 和 MuRF1 的水平而调节肌肉蛋白的降解和萎缩［29］。 因此，二陈汤可通过交互调节 PI3K-AKT、FoxO、HIF-1、MAPK 等信号通路对炎症反应、胰岛素抵抗、糖脂代谢、平滑肌增殖等生物学过程进行调整，从而起到化痰理气的功效。

本文采用网络药理学的思路和方法，从整体和系统的角度探讨二陈汤化痰的物质基础及其“异病同治”的内在机制。 然而，由于目前中药复方成分信息和生物信息学数据库仍不完善，在一定程度上限制了网络药理学分析的结果，因此对于分析结果需要进一步的实验验证［30-31］。