胸腔积液生物标志物对结核性和恶性胸腔积液的鉴别价值

胡 克， 胡卫华

（武汉大学人民医院呼吸与危重症医学二科，湖北 武汉 430060）

胸腔积液是一种常见的胸部疾病或并发症，可因多种疾病状态所致。 病因上，可为原发胸膜的疾病，也可继发于心、肝、肾、肺、纵隔、脾、卵巢、结缔组织病以及血液系统等疾病； 疾病类型包括肿瘤、感染性疾病、器官功能障碍和全身性疾病等，其中心力衰竭、恶性肿瘤、肺炎和结核所致胸腔积液占所有病例的3/4。 根据Light 标准，胸腔积液可分为渗出性和漏出性胸腔积液（分别简称为渗出液和漏出液）。漏出液患者多存在全身严重基础疾病，如充血性心力衰竭、肝硬化、肾病综合征、心包疾病等；渗出液的病因则更为复杂，以结核性胸腔积液（tuberculous pleural effusion，TPE） 和恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）最为常见。 在以淋巴细胞为主的渗出液中，TPE 和MPE 是2 种最常见的病因，两者不仅生化及常规实验室检查结果近似，而且临床表现也可相似，但治疗与预后相差巨大，对此正确鉴别甚为重要。

TPE 与其他病因所致胸腔积液尤其是与MPE的鉴别一直是临床难点。 诊断MPE 的“金标准”仍需依靠细胞学（在胸腔积液中发现肿瘤细胞）或组织病理学（胸膜活检标本发现相应病变），但需要获取合适标本。虽然内科胸腔镜是诊断胸腔积液病因最有价值的方法，但存在活检标本小、有创性及多种并发症等缺点；而对胸腔积液进行分析是研究其病因最简单易行的方法。 目前可用于诊断TPE 的主要标志物有腺苷脱氨酶 （adenosine deaminase，ADA）、γ-干扰素 （interferon γ，IFN-γ）、白介素-27（interlukine 27，IL-27）、IL-33 等；而诊断 MPE 的标志物虽有多种，但常因缺乏足够敏感性或特异性而使其临床应用受限， 探索可鉴别TPE 和MPE 的胸腔积液新型标志物始终是临床追求的目标。

胸腔积液生物标志物对TPE和MPE的鉴别价值

一、TPE 生物标志物

目前公认诊断TPE 的“金标准”是在胸腔积液中找到结核杆菌，或胸膜活检组织学可见典型干酪样结核性病理改变。不过胸膜结核是细菌学检出率很低的一种疾病，而这种局限性突显了胸腔积液中标志物对TPE 诊断的重要性，具有较高诊断价值的胸腔积液标志物包括ADA 以及与之诊断价值相当的 IFN-γ 和 IL-27。

1.ADA：目前临床上使用最广泛的是ADA，一种主要的T 淋巴细胞酶。 最近发表的包括16 项研究、共4 147 例患者的荟萃分析结果表明，ADA 对诊断TPE 的灵敏度为93%，特异度为92%[1]。ADA＞35 U/L 被认为存在结核感染； 老年患者的ADA 水平可能偏低，而细菌性胸膜炎（尤其是并发的肺炎旁胸腔积液和脓胸） 以及淋巴瘤所致胸腔积液中ADA 水平可能升高。 检测胸腔积液中ADA 的主要同工酶ADA2，可提高诊断TPE 的特异性[2]；不过，由于对ADA2 的检测方法尚未标准化，因此并未在临床上广泛应用。

2.IFN-γ：IFN-γ 是由 T 淋巴细胞产生的一种重要细胞因子， 反映机体的细胞免疫功能状态，研究发现，IFN-γ 对TPE 患者的检测阳性率明显高于非结核患者[3]。 包括 2 883 例患者、共 22 项研究的一项荟萃分析结果显示， IFN-γ 对TPE 的检测灵敏度和特异度分别为89%和97%， 曲线下面积（area under curve，AUC） 为 0.99[4]，但检测成本高以及未被广泛接受的最佳诊断界值是该项检测的局限性。 同时，IFN 释放试验（interferon release assays，IGRAs）是测定由特定分枝杆菌抗原刺激T 淋巴细胞释放IFN-γ，但对TPE 的诊断价值并不大。 在一项包括14 项研究、932 例TPE 患者的荟萃分析中，胸腔积液IGRAs [结核感染T 细胞斑点试验（TSPOT.TB）或QuantiFeron 试验]的灵敏度和特异度分别仅为72%和78%[5]。

3.IL-27：IL-27 作为 IL-12 家族新成员，近年来引起了研究者的浓厚兴趣，尤其是我国学者。 IL-27是一种由EB 病毒诱导基因3 和p28 亚基组成的异二聚体细胞因子[6]，主要由抗原提呈细胞分泌，通过对免疫反应的双重促炎和抗炎作用调节多种免疫疾病。 我国学者认为IL-27 可能参与胸腔积液的形成，并在结核分枝杆菌引发的免疫反应中起重要作用，具有一定的诊断价值[7]。迄今有3 项关于检测IL-27 对TPE 诊断价值的荟萃分析，其中最全面的一项包括7 项研究（大部分来自我国）、共1 157 例胸腔积液患者。结果显示，IL-27 对TPE 的诊断灵敏度为 93.8%，特异度 91.7%[8]。 但与 IFN-γ 相同的问题是，需要确定IL-27 的最佳诊断界值。

4.IL-33：IL-33 在上皮细胞和内皮细胞均有表达，细胞损伤后释放，在各种感染性和炎性疾病所致损伤中起重要作用。其生物学功能包括维持组织稳态，增强由辅助性 T 细胞 1（helper T cell 1，Th1）和Th2 介导的细胞免疫反应， 并在慢性炎症过程中介导纤维化。恶性肿瘤引起上皮细胞IL-33 表达下调， 而在肿瘤间质和血清中IL-33 表达上调[9]。Al-Aarag 等[10]检测117 例原因不明胸腔积液患者胸腔积液中的IL-33， 发现TPE 组IL-33 浓度明显高于 MPE 组（P＜0.001），而血清中 IL-33 水平差异无统计学意义； 取胸腔积液中IL-33 水平＞19.16 ng/L作为界值，诊断灵敏度为91.7%，特异度为96.4%；以胸腔积液/血清 IL-33 ＞1.4 作为诊断 TPE 的界值，则灵敏度为91.7%，特异度100%。 目前已有多项研究显示IL-33 在鉴别TPE 与MPE 中的意义，并显示出高灵敏度和特异度， 但样本量均较小，诊断界值也不一致，因此目前尚未得到广泛接受。

5.其他标志物： IL-31 是IL-6 细胞因子家族成员，主要参与机体炎性反应。 Gao 等[11]发现TPE 患者血浆中 IL-31 水平高于 MPE 患者 （P=0.000 2）；以23.9 pg/mL 为界值， 诊断TPE 的灵敏度和特异度分别为92.9%和85.7%； 联合检测胸腔积液及血浆结核特异性IL-31 水平，灵敏度和特异度分别提高到94.0%和95.1%。 因而认为IL-31 是一种新的TPE 标志物。

一些研究者还探讨了IL-2[12]、结核分枝杆菌合成的外分泌蛋白Ag85A[13]、趋化因子-10 及单核细胞趋化因子-1[14]等在鉴别TPE 与其他病因所致胸腔积液中的作用，但因研究规模小、灵敏度和特异度差异大等因素而未被广泛接受。

二、MPE生物标志物

对MPE 的确诊主要依靠细胞学及病理学。 胸腔积液中细胞检出率受肿瘤类型等多种因素的影响，通常MPE 细胞学阴性率可达40%，而在间皮瘤和鳞状细胞癌则高达70%～85%[15-16]。为提高对MPE的诊断，以可溶性蛋白为基础、免疫细胞化学法及主要基于核酸检测的肿瘤分子标志物已逐步应用于临床。

1.乳酸脱氢酶 （lactic dehydrogenase，LDH）：LDH 广泛存在于人体组织内， 当组织受损时，LDH可释放入血。 MPE 中 LDH 水平可显著升高，当LDH≥1 000 U/L，且胸腔积液 LDH/血清LDH＞1.0时，应高度怀疑MPE。

2.癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）与糖链抗原（carbohydrate antigen，CA）：最早且使用最广泛的标志物是CEA 和CA15-3，但两者的诊断特异性并不高，且诊断界值较高；临床上为排除由其他原因所引起的异常，只在这些指标高于参考范围上限的数倍时才考虑肿瘤可能。最近一项研究评价了1 575 例非化脓性渗出性胸腔积液患者胸腔积液中CEA 和CA15-3 水平的诊断准确性，以特异度100%为界值， 结果发现，41%患者 CEA＞45 ng/mL，40%患者 CA15-3＞77 U/L，60%患者为两者之一[17]。CA12-5、CA19-9、细胞角蛋白 19 片段抗原 21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA 21-1）（细胞角蛋白19 的一个片段）是另外3 种可溶性蛋白质标志物。 2008 年Liang 等[18]就肿瘤标志物对MPE 的诊断准确率进行荟萃分析， 发现CA12-5、CA15-3、CA19-9 和 CYFRA21-1 的 灵 敏 度 分 别 为0.48、0.51、0.25 和 0.55， 特异度分别为 0.85、0.96、0.96 和 0.91； 提示检测 CA12-5 和 CA19-9 水平对MPE 的诊断价值有限， 而 CA15-3 和 CYFRA21-1的诊断效果更佳。2015 年 Nguyen 等[19]对 49 项肿瘤标志物在MPE 中的诊断价值进行荟萃分析， 认为CYFRA、CA12-5 灵敏度更高 （分别为 0.625、0.575），但特异度均不高。上述两项荟萃分析均认为联合检测2 种或2 种以上肿瘤标志物可提高对MPE 的诊断价值。 2017 年Yang 等[20]对联合检测肿瘤标志物在MPE 中的诊断准确性进行荟萃分析， 认为对于未确诊胸腔积液患者，联合检测CEA + CA15-3 阳性与CEA + CA19-9 阳性宜高度怀疑胸腔恶性肿瘤，但检测敏感性较低。

3.神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）：NSE 是糖酵解烯醇酶 γ-亚基， 由神经内分泌细胞以及神经源性肿瘤分泌，NSE 被认为是小细胞肺癌的生物标志。Saba 等[21]探讨了联合检测NSE 和CA15-3 对MPE 的诊断价值， 结果显示检测血清 NSE 的灵敏度为 75.0%， 特异度为69.4%；胸腔积液中NSE 的灵敏度为75.0%，特异度为73.5%；联合检测血清与胸腔积液中NSE、CA15-3 的灵敏度最高为93.2%， 最低47.7%。 胸腔积液NSE 的诊断准确率为74.2%，诊断效价最高。 在一项包括49 种肿瘤标志物对MPE 诊断价值的荟萃分析中，NSE 对MPE 的诊断灵敏度和特异度分别为0.613 和 0.884[21]。 虽然NSE 对于小细胞肺癌的诊断具有一定意义，但确诊依然以组织病理学结果为主。

4.鳞状上皮细胞癌 （squamous cell carcinoma，SCC） 抗原：SCC 抗原是肿瘤相关抗原 TA-4 的亚型，是一种糖蛋白，存在于子宫、宫颈、肺、头颈等SCC 的细胞浆中，特别在非角化癌细胞中的含量更丰富，在临床上常被用于肺鳞癌、宫颈癌、食管癌、皮肤鳞状细胞癌的诊断。 近年来单独检测SCC 抗原的研究较少，通常与其他多种肿瘤标志物联合检测来诊断MPE。 Gu 等[22]探讨了联合检测MPE 患者血清及胸腔积液中多种肿瘤标志物的水平，结果显示血清中SCC 抗原的界值为0.85 ng/mL，胸腔积液中SCC 抗原的界值为1.35 ng/mL， 血清SCC 抗原/胸腔积液 SCC 抗原为 0.9， 胸腔积液 CEA/血清CEA 的特异度和灵敏度最高， 分别为97.14%和61.05%。 国内甘洁民等[23]检测88 例肺部恶性疾病、132 例肺部良性疾病患者和128 名健康对照者血清SCC 抗原， 结果发现肺部良、恶性疾病组血清SCC 抗原水平均有不同程度升高，以肺鳞癌组最高（阳性率76%），其次为肺炎组。SCC 抗原在肺炎、肾功能不全、皮肤病等疾病均可升高，因此特异性并不强，在将SCC 抗原用于SCC 的辅助诊断、复发监测和预后判断时要注意排除上述疾病或与之相鉴别。

5.细胞因子：当机体胸膜发生病变后可导致细胞因子发生变化[24]，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及内皮抑素被认为是肿瘤血管生成过程中最重要的调控因子。VEGF 通过刺激肿瘤血管生成、激活宿主血管内皮细胞、促进恶性增殖等功能参与肿瘤生长的全过程； 而内皮抑素则可诱导血管内皮细胞凋亡，破坏肿瘤血管结构，抑制肿瘤生长。VEGF 及内皮抑素在MPE 患者胸腔积液中含量较高，是具有重要诊断价值的标志物。 与非MPE 相比，MPE 患者胸腔积液中VEGF 水平较良性胸腔积液患者升高1.93 ng/mL[25]。 内皮抑素诊断MPE 的灵敏度和特异度分别为51.92%和 85.94%，AUC 为 0.747。 联合应用内皮抑素和CEA 可提高MPE 的诊断能力[26]。

6.DNA 倍体： 脱落细胞学是临床上常用的鉴别胸腔积液良恶性的诊断方法， 但阳性率较低，而DNA 倍体诊断MPE 的准确率高于脱落细胞学。 国外已于20 世纪70 年代得出 “DNA 异倍体是恶性肿瘤高度特异性标志”这一结论。近年来研究显示，DNA 倍体联合多种肿瘤标志物可提高诊断准确性。 MPE 中微小 RNA-21（miR-21）和 miR-24 的表达明显高于良性胸腔积液，DNA 倍体联合miR-21及DNA 倍体联合miR-24 均能显著提高MPE 诊断特异度和灵敏度[27]。 国内有研究使用图像分析仪诊断MPE 的DNA 倍体具有较高的灵敏度和特异度，DNA 倍体联合CEA 和血清蛋白铁也可提高诊断价值[28]。

7.胸膜间皮瘤相关生物标志物：间皮瘤是指起源于间皮细胞的一类疾病，可发生于胸膜、腹膜和心包等组织，胸膜间皮瘤由于胸腔积液中细胞学检查阳性率较低，因此常难以作出诊断。 目前尚没有可接受、能准确鉴别原发性胸膜肿瘤的可溶性生物标志物。 研究中的生物标志物包括间皮素、骨桥蛋白和腓骨蛋白-3，但只有间皮素获得美国食品和药品监督管理局批准在临床应用，胸腔积液中可溶性间皮素较血清中间皮素更敏感。血清骨桥蛋白及腓骨蛋白-3 对间皮瘤的诊断价值不大。

良、恶性间皮瘤的治疗及预后相差较大，因此正确区分两者的意义巨大。 有关鉴别良、恶性间皮细胞增生的文献非常丰富，目前认为可标志良性反应性间皮瘤的有肌间线蛋白、上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）、单克隆抗体（克隆号E29）、p53、葡萄糖转运体-1 （glucose transporter 1，GLUT-1）、胰岛素样生长因子-2 信使 RNA 结合前蛋白-3 （insulin-like growth-factor 2 messenger ribonucleic acid-binding protein 3, IMP-3）等。然而，这些标志物在良、恶性间皮瘤中的表达有太多重叠，且差异极大。目前可用来鉴别恶性间皮瘤与反应性间皮细胞增生的新标志物有乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）相关蛋白-1（BRCA1-associated protein，BAP-1）和 p16/周期蛋白依赖性激酶抑制因子 2A （cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）2 种； 如果以免疫细胞化学法检测到细胞核BAP-1 存在缺失，提示恶性胸膜间皮瘤，主要是上皮样亚型（在肉瘤和纤维瘤变异体中非常少见）。 上皮样恶性间皮瘤BAP-1 蛋白缺失率在 55%～80%之间[29-30]。 如果无 BAP-1 缺失，或者怀疑是肉瘤样间皮瘤，则应进行荧光原位杂交来检测p16 纯合缺失； 已发现高达80%胸膜间皮瘤存在54 个p16 缺失 （肉瘤样亚型90%、上皮样亚型70%和双相亚型70%）， 而在良性反应性间皮细胞增生中既无BAP-1 缺失，也无p16 缺失[30]。

未来生物标志物

目前正在研究旨在发现血液、胸腔积液或胸膜组织中新的生物标志物，涉及基因组学（DNA）、转录组学（所有RNA 类型）、蛋白质组学（蛋白质）和代谢组学（小分子或代谢物），并利用高通量方法探讨潜在生物标志物。 在转录后水平，一些在胸膜组织或体液中调节基因表达的微RNA 已被作为胸膜间皮瘤的潜在标志物[31]。 在蛋白质组学方面，以生物芯片检测与癌症相关的蛋白生物标志物以及这些标志物在MPE 与TPE、肺腺癌与胸膜间皮瘤之间的差别[32]。 最后，通过高分辨磁共振光谱研究不同胸腔积液代谢谱，分析其间的代谢产物如乳酸、氨基酸或脂类， 这或许也有助于鉴别良性胸腔积液与MPE[33]。

综上所述，胸腔积液是临床常见疾病，病因复杂，正确的病因诊断对疾病治疗和预后起决定性作用。 胸腔积液标志物中 ADA、IFN-γ、IL-27 在诊断TPE 上的灵敏度和特异度均达到90%，具有较高的临床价值。 其他具有一定诊断意义的标志物包括IL-33、IL-31、IL-2、结核分枝杆菌合成的外分泌蛋白Ag85A 等。 虽然有研究显示 IL-33 及 IL-31 的诊断灵敏度和特异度较高，但因实验证据不足及差异性较大未被广泛接受。 对于MPE，目前诊断仍依赖于细胞学及组织病理学，多种生物标志物的灵敏度及特异度均有限， 应用最广的是CEA、CA12-5 以及CA15-3，联合检测多种肿瘤标志物可显著提高诊断价值。 诊断由间皮瘤导致的胸腔积液仍较困难，对多种标志物包括蛋白质组学、基因组学等的研究尚在进行中。