EGFR 在肺泡上皮不典型腺瘤样增生中表达和突变的意义研究

（岳阳职业技术学院 医学基础部，湖南 岳阳 414000）

据报道，肺癌的发病率位居中国前10 位恶性肿瘤之首。尽管肺癌的治疗已发展到手术、放疗、化疗以及分子靶向药物等综合治疗阶段，但预后仍然很差，患者的长期生存仍未得到明显改善，其主要原因与肺癌的早期诊断较为困难，确诊时往往已进入中晚期有关。

研究发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）在肺癌中高表达并存在基因突变[1]，在肺泡上皮不典型腺瘤样增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）也存在类似表现，而AAH 是肺癌特别是肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LAC）及其亚型细支气管肺泡癌（Bronchioloalveolar carcinoma，BAC）的癌前病变甚至早期癌[2-5]。本研究旨在探讨可否通过检测AAH 中EGFR 的过表达和（或）其基因突变从而实现肺癌的早期诊断。

1 对象与方法

1.1 对象

收集中南大学湘雅二医院2006 年1 月-2010年6 月间经病理确诊为AAH 的病例，其中包括23 例单纯AAH 病变病例和18 例癌旁肺泡上皮不典型增生病例。组织学上表现为低度AAH 的病例24 例，表现为高度AAH 的病例17 例。41 例病例中，男性21 例，女性20 例，男女比例为1.05∶1；患者年龄31-73 岁，中位年龄59 岁。在复习全部HE 切片并经2 名副教授以上的病理科医生确定诊断后，确定典型石蜡包埋组织块。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化

采用免疫组织化学技术S-P 法（链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连结法），进行EDTA 抗原热修复和AEC 对比染色。

1.2.2 结果判断和分析

EGFR、EGFR（E746-A750del Specific）、EGFR（L858R Mutant Spectific）的免疫组织化学染色阳性均呈浅棕色或棕红色，表达在细胞膜和/或细胞浆。评分标准为：不显色或显色弱阳性且阳性细胞数＜10%为0 分；显色弱阳性且阳性细胞数＞10%记1+；中度阳性记2+；强阳性记3+。本实验出现1+、2+、3+即为EGFR、EGFR（E746-A750del Specific）、EGFR（L858R Mutant Spectific）染色阳性，0 分为阴性。以美国Cell Signaling（CST）公司提供的阳性对照片为阳性对照，PBS 溶液代替一抗作为阴性对照。

采用SPSS18 统计软件进行数据分析。采用χ2检验，P ＜0.05 为差异，有统计学意义。做相关性分析，r 值范围－1～＋1，r=0 表示零相关，r ＜0 为负相关，越接近－1 负相关程度越高；r ＞0 为正相关，越接近＋1 正相关程度越高。（0＜|r|＜0.19 极低相关；0.20 ＜|r|＜0.39 低度相关；0.40 ＜|r|＜0.69 中度相关；0.70 ＜|r|＜0.89高度相关；0.90 ＜|r|＜0.10 极高相关）

2 结果

2.1 EGFR 蛋白阳性表达及其第19、21 号外显子突变与不同程度AAH 的关系

2.1.1 EGFR 蛋白阳性表达与不同程度AAH 的关系

41 例病例中17 例高度AAH 的病例EGFR 蛋白全部表达为阳性，24 例低度AAH 病例中的只有17 例EGFR 蛋白表达阳性，两者比较，差异有统计学意义（P ＜0.05，表1）。

表1 EGFR 蛋白表达与不同程度AAH 的关系

2.1.2 第19 号外显子突变蛋白表达与不同程度AAH 的关系

17 例高度AAH 病例中有13 例出现第19号外显子突变，表现为EGFR（E746-A750del Specific）突变蛋白表达阳性，24 例低度AAH 病例中的1 例第19 号外显子突变，两者比较，差异有统计学意义（P ＜0.05，表2）。

表2 第19 号外显子突变蛋白表达与不同程度AAH 的关系

2.1.3 第21 号外显子突变蛋白表达与不同程度AAH 的关系

17 例高度AAH 病例中有7 例第21 号外显子突变，表现为EGFR（L858R Mutant Spectific）突变蛋白表达阳性，24 例低度AAH 病例中的2 例第21 号外显子突变，两者比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表3 第21 号外显子突变蛋白表达与不同程度AAH 的关系

2.2 EGFR 基因第19、21 号外显子突变与EGFR蛋白阳性表达的关系

2.2.1 EGFR 基因第19 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达的关系

EGFR 基因第19 号外显子突变的AAH 患者EGFR 蛋白阳性表达率为100%，野生型的27 例AAH 患者中有20 例出现EGFR 蛋白阳性表达，阳性率为70.4%，AAH 患者EGFR 基因第19 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达呈低度正相关（r=0.3267，P＜0.05，表4）。

表4 EGFR 基因第19 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达的关系

2.2.2 EGFR 基因第21 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达的关系（表5）

EGFR 基因第21 号外显子突变的AAH 患者EGFR 蛋白阳性表达率为100%，野生型的32 例AAH 患者中25 例EGFR 蛋白阳性表达，阳性率为75%，AAH 患者EGFR 第21 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达呈低度正相关（r=0.2406，P＜0.05，表5）。

表5 EGFR 基因第21 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达的关系

2.3 EGFR 蛋白阳性表达及其第19、21 号外显子突变与AAH 患者性别、年龄的关系

2.3.1 EGFR 蛋白阳性表达与AAH 患者性别、年龄的关系

AAH 组织中EGFR 蛋白阳性表达率为82.9%（34/41）。男性组EGFR 蛋白阳性表达率为76.2%，女性组为90.0%，二组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表6）；年龄≤50 岁组、51-60 岁组、＞60 岁组EGFR 蛋白阳性表达率分别为70.0%、100%、77.8%，三组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表7）。

表6 AAH 组织中EGFR 蛋白阳性表达与AAH 患者性别的关系

表7 AAH 组织中EGFR 蛋白阳性表达与AAH 患者年龄的关系

2.3.2 EGFR 基因第19 号外显子突变与AAH 患者性别、年龄的关系

41 例AAH 患者中，男性组EGFR 基因第19号外显子突变率为33.3%，女性组为35.0%，二组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表8）；年龄≤50 岁组、51～60 岁组、＞60 岁组EGFR 基因第19 号外显子突变率分别为20.0%、38.5%、38.9%，三组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表9）。

表8 EGFR 基因第19 号外显子突变与AAH 患者性别的关系

表9 EGFR 基因第19 号外显子突变与AAH 患者年龄的关系

2.3.3 EGFR 基因第21 号外显子突变与AAH 患者性别、年龄的关系

41 例AAH 患者中，男性组EGFR 基因第21 号外显子突变率为14.3%，女性组30.0%，二组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表10）；年龄≤50 岁组、51-60 岁组、＞60 岁组EGFR 基因第21 号外显子突变率分别为10.0%、30.8%、22.2%，三组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表11）。

表10 EGFR 基因第21 号外显子突变与AAH 患者性别的关系

表11 EGFR 基因第21 号外显子突变与AAH 患者年龄的关系

2.4 癌旁肺泡上皮不典型增生与单纯AAH 病变的比较

41 例AAH 患者中癌旁肺泡上皮不典型增生组有18 例，其中男性10 例，女性8 例，男女比例为1.25:1，平均年龄60.7 岁；单纯AAH 病变的有23例，男性11例，女性12例，男女比例为1:1.09，平均年龄53.7 岁。癌旁肺泡上皮不典型增生与单纯AAH 病变在EGFR 蛋白阳性表达上、EGFR 基因第19 号外显子突变蛋白表达上及EGFR 基因第21 号外显子突变蛋白表达上均有显著性差异，有统计学意义（P＜0.05，表12）。

表12 癌旁肺泡上皮不典型增生患者与单纯AAH 病变患者的比较

3 讨论

EGFR是一种对细胞生长发育起重要作用的糖蛋白，但当它异常表达时可造成细胞的过度增殖。大量的研究证实EGFR 和多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及预后有着相当密切的关系，尤其是非小细胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 是肺癌的主要类型，其中LAC约占NSCLC 的1/3；而BAC 是LAC 亚型之一，约占NSCLC 的5%-25%[6]。有研究显示，80%-90%的NSCLC 患者有EGFR 的过度表达，且突变率可高达42.6%，尤以LAC、BAC 中为高，远远高于其他组织学类型[7]。本研究检测了BAC 和LAC 的癌前病变（早期癌）AAH中EGFR蛋白呈阳性反应，与既有的研究结果相一致；而AAH 根据其细胞形态学特点和异型性大小可分为高、低两个级别，检测结果显示，高度AHH 中EGFR 蛋白的表达阳性率高于低度AAH。另外，EGFR 属于受体型酪氨酸激酶，在其酪氨酸激酶区域附近的ATP 结合区域周围是EGFR 突变的主要集中位置，其中第19 号外显子及第21 号外显子的突变是两种最主要的突变形式，占所有突变覆盖率的90%。有文献报道，EGFR 基因在LAC 尤其是BAC 中有较高的突变率[8]。本研究检测发现，AAH 中EGFR第19 号外显子及第21 号外显子存在突变，且高度AAH 中的突变率高于低度AAH。以上结果说明，AAH 从低度到高度的发展过程中EGFR 蛋白的阳性表达及其第19、21 号外显子突变均呈递增趋势，提示EGFR 蛋白的过表达及其第19、21 号外显子突变与AAH 的发生、发展有关。进一步分析AAH 中EGFR 基因第19 号和21 号外显子突变与EGFR 蛋白阳性表达的相关性，结果呈正相关，提示在AAH 到BAC 的发展过程中，EGFR 基因第19、21 号外显子突变可能导致EGFR 蛋白的高表达。但是，AAH 中EGFR 蛋白表达及其第19、21 号外显子突变与患者的性别及年龄无关。

AAH 作为癌前病变，特别是高度AAH 可发展为肺癌。研究报道，EGFR 在AAH 到浸润性肺腺癌中均有阳性表达并呈递增趋势，被认为在AAH 和肺腺癌的发展过程中起重要作用，可能促进AAH 发展到腺癌的过程。本研究发现，癌旁AAH 与单纯AAH 中EGFR 蛋白阳性表达率、EGFR 基因第19 号外显子和第21 号外显子突变率存在显著性差异，前者明显高于后者，表明随着AAH 病变的进一步发展，EGFR 蛋白的阳性表达及其第19、21 号外显子突变也会呈递增趋势，与报道的结果表现一致。另有研究发现癌旁AAH患者（平均年龄为57.5 岁）男女比例无差别，而单纯AAH 患者（平均年龄为44.5 岁）女性多发[9]。本研究中，癌旁AAH 患者与单纯AAH 病变患者平均年龄都大于报道的研究结果，可能与所取样本资料的差异有关；在性别比例上，癌旁AAH 患者男性略多于女性，而单纯AAH 患者女性稍多于男性，但二者均相差不大。

综上所述，检测AAH中EGFR的过表达和（或）基因突变对BAC 和LAC 的早期诊断可能具有重要意义，为肺癌的早期诊断和治疗提供理论依据，也为进一步研究肺癌的发病机制奠定基础。